Молекулярний біолог – це дослідник у галузі медицини, місія якого полягає, ні багато ні мало, у рятуванні людства від небезпечних хвороб. Серед таких захворювань, наприклад, онкологія, яка на сьогоднішній день стала однією з головних причин смертності у світі, лише трохи поступаючись лідеру – серцево-судинним захворюванням. Нові методи ранньої діагностики онкології, запобігання та лікування раку – пріоритетне завдання сучасної медицини. Молекулярні біологи в галузі онкології розробляють антитіла та рекомбінантні (генетично спроектовані) білки для ранньої діагностики або цільової доставки ліків в організмі. Фахівці цієї сфери використовують найсучасніші досягнення науки та техніки для створення нових організмів та органічних речовин з метою їх подальшого використання у дослідній та клінічній діяльності. Серед методів, які використовують молекулярні біологи, – клонування, трансфекція, інфекція, полімеразна ланцюгова реакція, секвенування генів та інші. Одна з компаній, зацікавлених у молекулярних біологах у Росії, - ТОВ «ПраймБіоМед». Організація займається виробництвом антитіл-реагентів для діагностики онкологічних захворювань. Такі антитіла в основному використовуються для визначення типу пухлини, її походження та злоякісності, тобто здатності до метастазування (поширення в інші частини організму). Антитіла наносяться на тонкі зрізи досліджуваної тканини, після чого зв'язуються в клітинах з певними білками – маркерами, які є в пухлинних клітинах, але відсутні в здорових і навпаки. Залежно від результатів дослідження, призначається подальше лікування. Серед клієнтів «ПраймБіоМед» – не лише медичні, а й наукові установи, оскільки антитіла можуть використовуватись і для вирішення дослідницьких завдань. У таких випадках можуть бути зроблені унікальні антитіла, здатні зв'язуватися з білком, що досліджується, під конкретне завдання за спеціальним замовленням. Ще один перспективний напрямок досліджень компанії – таргетна (цільова) доставка ліків в організмі. У разі антитіла використовуються як транспорт: з допомогою ліки доставляються безпосередньо до ураженим органам. Таким чином, лікування стає більш ефективним і має менше негативних наслідківдля організму, ніж, наприклад, хіміотерапія, яка вражає як ракові, а й інші клітини. Професія молекулярного біолога протягом найближчих десятиліть, як очікується, буде все більш затребуваною: зі збільшенням середньої тривалості життя людини кількість онкологічних захворювань збільшуватиметься. Рання діагностика пухлин та інноваційні способи лікування за допомогою отриманих молекулярними біологами речовин дозволять врятувати життя та покращити його якість величезній кількості людей.

Молекулярна біологія / м? лɛ доJʊ лər / є гілкою біології, що стосується молекулярної основи біологічної активності між біомолекулами в різних системах клітини, у тому числі взаємодій між ДНК, РНК, білків та їх біосинтезу, а також регулювання цих взаємодій. Запис у природі 1961 року, Астбері описав молекулярну біологію:

Не так техніка, як підхід, підхід з погляду так званих фундаментальних наукз провідною ідеєю пошуку нижче за великомасштабні прояви класичної біології для відповідного молекулярного плану. Він стурбований тим, зокрема, з формамибіологічних молекул і [...] переважно тривимірним і структурно - що не означає, однак, що це лише уточнення морфології. Він має водночас досліджувати генезис та функції.

Ставлення до інших біологічних наук

Дослідники в галузі молекулярної біології використовують специфічні методи ростуть молекулярну біологію, але все більше і більше комбінують їх з методами та ідеями від генетики та біохімії. Існує не певна межа між цими дисциплінами. Це показано на наступній схемі, що зображує один можливий вид відносин між полями:

  • Біохімія є вивчення хімічних речовині життєво важливих процесів, що відбуваються в живих організмах. Біохіміки важко зосередитися на ролі, функції та структури біомолекул. Вивчення хімії за біологічних процесів та синтезу біологічно активних молекул є прикладами біохімії.
  • Генетика є вивчення впливу генетичних відмінностей у організмах. Це часто може бути виведено у відсутності нормальної компоненти (наприклад один ген). Вивчення «мутанти»-організми мають один або більше функціональні компоненти по відношенню до так званого «дикого типу» або нормального фенотипу. Генетичні взаємодії (епістаз) часто плутають прості інтерпретації таких «нокаут» дослідження.
  • Молекулярна біологія є вивчення молекулярних основ процесів реплікації, транскрипції, трансляції та функції клітин. Центральна догма молекулярної біології, де генетичний матеріал транскрибується в РНК і потім транслюється в білок, незважаючи на спрощене, як і раніше забезпечує хорошу початкову точку для розуміння поля. Картина була переглянута у світлі нових ролей для РНК .

Методи молекулярної біології

Молекулярне клонування

Одним із найголовніших методів молекулярної біології для вивчення функції білка є молекулярним клонуванням. У цій техніці ДНК, що кодує білок, що представляє інтерес, клонованої за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), та/або ферменти рестрикції в плазміді (вектора експресії,). Вектор має 3 відмінні риси: початок реплікації, а сайт множинного клонування (MCS), і селективний маркер, як правило, зі стійкістю до антибіотиків. Розташовані вище сайт множинного клонування є промоторними областями та транскрипції сайту ініціації, які регулюють експресію клонованого гена. Ця плазміда може бути вставлена ​​в або бактеріальні або тваринні клітини. Введення ДНК у бактеріальні клітини може бути зроблено шляхом трансформації за допомогою поглинання голої ДНК, кон'югацій за допомогою міжклітинних контактів або трансдукції за допомогою вірусного вектора. Введення ДНК в еукаріотичні клітини, такі як клітини тварин, за допомогою фізичних чи хімічних засобів, називається трансфекцією. Декілька різних методів трансфекції доступні, такі як фосфат кальцію трансфекції, електропорації, мікроін'єкції та ліпосомальної трансфекції. Плазміда може бути інтегрована в геном, що призводить до стабільної трансфекції, або може залишатися незалежними від генома, званого перехідними процесамитрансфекції.

ДНК, що кодують білки, що представляє інтерес, в даний час всередині клітини, і білки тепер можуть бути виражені. Різноманітні системи, такі як індуцибельні промотори та специфічних клітинних сигнальних факторів, які допоможуть висловити інтерес білок на високих рівнях. Великі кількості білка можуть бути витягнуті з бактеріальної або еукаріотичної клітини. Білок може бути перевірений на ферментативну активністьпри різних ситуаціях, білка можна кристалізувати, тому його третинна структура може бути вивчена, або, у фармацевтичній промисловості, активність нових препаратів проти білка може бути вивчена.

Полімеразної ланцюгової реакції

Макромолекули-блот та дослідження

Терміни північний , західнийі східнийБлоттінг отримує з, що спочатку була молекулярна біологія жарт, яка грала на терміні Саузернетпісля методики, описаної Edwin Southern для гібридизації BLOTTED ДНК. Патриція Томас, розробник РНК - блот, який потім став відомий як північному - блотінгу, насправді не використовувати цей термін.

Саузернблот

Названий на честь його винахідника, біолог Едвін Південний, то Саузерн - блот є методом дослідження на наявність специфічної послідовності ДНК у зразку ДНК. Зразки ДНК до або після ферменту рестрикції (рестриктаз) переварювань розділені за допомогою електрофорезу в гелі, а потім переносили на мембрану за допомогою блот з допомогою капілярної дії . Мембрану потім піддають впливу міченого ДНК - зонда, який має послідовність підстав доповненням до послідовності на ДНК, що становить інтерес. Саузерн - блоттінг менш широко використовується в науковій лабораторії через здатність інших методів, таких як ПЛР, для виявлення специфічних послідовностей ДНК із зразків ДНК. Ці блоти все ще використовуються для деяких застосувань, однак, таких як вимірювання трансгену числа копій у трансгенних мишах або в інженерії гена нокаутних ліній ембріональних стовбурових клітин.

Північний Блоттинг

Northern блот діаграма

Східно-блотингу

Клінічні дослідження та медичні методи лікування, що випливають із молекулярної біології, частково охоплені генною терапією. Застосування молекулярної біології чи молекулярних клітинна біологія підходів у медицині тепер називається молекулярною медициною. Молекулярна біологія також відіграє важливу роль у розумінні освіти, дій та нормативних актів. різних частинклітин, які можуть бути використані для ефективних призначаються нові ліки, хвороба діагнозу і зрозуміти фізіологію клітини.

подальше читання

  • Cohen, SN, Чанг, НКД, Бойєр, H. & Heling, RB Конструювання біологічно функціональних бактеріальних плазмід у пробірці .

31.2

Для друзів!

Довідка

Молекулярна біологія зросла з біохімії у квітні 1953 року. Її поява пов'язана з іменами Джеймса Вотсона і Френка Крика, які відкрили структуру молекули ДНК. Відкриття стало можливим завдяки дослідженню генетики, бактерій та біохімії вірусів. Професія молекулярний біолог не має широкого поширення, але на сьогоднішній день її роль у сучасному суспільствідуже велика. Велика кількість захворювань, у тому числі проявляються на генетичному рівні, вимагає від вчених пошуку рішень цієї проблеми.

Опис діяльності

Віруси та бактерії постійно мутують, а це означає, що людині перестають допомагати ліки та хвороби стають важковиліковними. Завдання молекулярної біології – випередити цей процес та розробити новий засіб від хвороб. Вчені працюють за налагодженою схемою: блокування причини захворювання, усунення механізмів спадковості та полегшення тим самим стану пацієнта. У світі існує низка центрів, клінік та лікарень, де молекулярні біологи на допомогу пацієнтам розробляють нові способи лікування.

Трудові обов'язки

До обов'язків молекулярного біолога входить вивчення процесів усередині клітини (наприклад, зміни у ДНК у разі розвитку пухлин). Також фахівці вивчають особливості ДНК, їх вплив на цілий організм та окрему клітину. Такі дослідження проводяться, наприклад, на підставі ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція), яка дозволяє зробити аналіз організму на інфекції, спадкові захворювання та визначити біологічну спорідненість.

Особливості кар'єрного зростання

Професія молекулярний біолог є досить перспективною у своїй сфері і вже сьогодні претендує на перші місця в рейтингу медичних професій майбутнього. До речі, молекулярному біологу не обов'язково постійно залишатися в цій сфері. Якщо виникне бажання змінити рід занять, він може перекваліфікуватися на менеджери з продажу лабораторного обладнання, почати розробляти прилади для різних досліджень або відкрити свою справу.

Молекулярний біолог – це дослідник у галузі медицини, місія якого полягає, ні багато ні мало, у рятуванні людства від небезпечних хвороб. Серед таких захворювань, наприклад, онкологія, яка на сьогоднішній день стала однією з головних причин смертності у світі, лише трохи поступаючись лідеру – серцево-судинним захворюванням. Нові методи ранньої діагностики онкології, запобігання та лікування раку – пріоритетне завдання сучасної медицини. Молекулярні біологи в галузі онкології розробляють антитіла та рекомбінантні (генетично спроектовані) білки для ранньої діагностики або цільової доставки ліків в організмі. Фахівці цієї сфери використовують найсучасніші досягнення науки та техніки для створення нових організмів та органічних речовин з метою їх подальшого використання у дослідній та клінічній діяльності. Серед методів, які використовують молекулярні біологи – клонування, трансфекція, інфекція, полімеразна ланцюгова реакція, секвенування генів та інші. Одна з компаній, зацікавлених у молекулярних біологах у Росії, - ТОВ «ПраймБіоМед». Організація займається виробництвом антитіл-реагентів для діагностики онкологічних захворювань. Такі антитіла в основному використовуються для визначення типу пухлини, її походження та злоякісності, тобто здатності до метастазування (поширення в інші частини організму). Антитіла наносяться на тонкі зрізи досліджуваної тканини, після чого зв'язуються в клітинах з певними білками – маркерами, які є в пухлинних клітинах, але відсутні в здорових і навпаки. Залежно від результатів дослідження, призначається подальше лікування. Серед клієнтів «ПраймБіоМед» – не лише медичні, а й наукові установи, оскільки антитіла можуть використовуватись і для вирішення дослідницьких завдань. У таких випадках можуть бути зроблені унікальні антитіла, здатні зв'язуватися з білком, що досліджується, під конкретне завдання за спеціальним замовленням. Ще один перспективний напрямок досліджень компанії – таргетна (цільова) доставка ліків в організмі. У разі антитіла використовуються як транспорт: з допомогою ліки доставляються безпосередньо до ураженим органам. Таким чином, лікування стає більш ефективним і має менше негативних наслідків для організму, ніж, наприклад, хіміотерапія, яка вражає не лише ракові, а й інші клітини. Професія молекулярного біолога протягом найближчих десятиліть, як очікується, буде все більш затребуваною: зі збільшенням середньої тривалості життя людини кількість онкологічних захворювань збільшуватиметься. Рання діагностика пухлин та інноваційні способи лікування за допомогою отриманих молекулярними біологами речовин дозволять врятувати життя та покращити його якість величезній кількості людей.

Основна професійна освіта

Відсотки відображають розподіл спеціалістів із певним рівнем освіти на ринку праці. Ключові спеціалізації для освоєння професії відзначені зеленим кольором.

Здібності та навички

  • Вміння поводитися з реактивами, зразками, треба вміти працювати з малими об'єктами
  • Навички роботи з великим обсягом інформації
  • Вміння працювати руками

Інтереси та переваги

  • Прагнення дізнаватися про щось нове
  • Вміння працювати в режимі багатозадачності (необхідно стежити за перебігом кількох реакцій та процесів одночасно)
  • Акуратність
  • Відповідальність (не можна залишити роботу «на завтра», оскільки зразки можуть бути зіпсовані)
  • Скрупульозність
  • Працьовитість
  • Уважність (необхідно стежити за мікропроцесами)

Професія в особах

Марія Шитова

Дарія Самойлова

Олексій Грачов

Молекулярна біологія в галузі онкології - перспективне професійний напрямок, оскільки боротьба з раком – одне з пріоритетних завдань світової медицини.

Фахівці-молекулярні біологи затребувані у багатьох галузях у зв'язку з активним розвитком науки, біотехнологічних та інноваційних підприємств. На сьогоднішній день спостерігається невеликий дефіцит фахівців, які особливо мають досвід роботи зі спеціальності. Досі достатньо велика кількістьвипускників продовжує їхати працювати за кордон. Зараз починають з'являтися можливості ефективної роботи в галузі біотехнології в Росії, але про масовість говорити поки що рано.

Робота молекулярного біолога передбачає активну участь фахівця в наукової діяльностіяка стає механізмом кар'єрного просування. Розвиток у професії можливий через участь у наукових проектах та конференціях, можливий через освоєння суміжних галузей знання. Також надалі можливий академічний розвиток від молодшого наукового співробітника через старшого наукового співробітника до провідного наукового співробітника, професора та/або завідувача відділу/лабораторії.

Розвиток біохімії, біофізики, генетики, цитохімії, багатьох розділів мікробіології та вірусології приблизно на початок 40-х років XX ст. впритул підвело до вивчення життєвих явищ на молекулярному рівні. Успіхи, досягнуті цими науками, одночасно і з різних боків призвели до усвідомлення того факту, що саме на молекулярному рівні функціонують основні керуючі системи організму і що подальший прогрес цих наук залежатиме від розкриття біологічних функціймолекул, що становлять тіла організмів, їх участі у синтезі та розпаді, взаємних перетвореннях та репродукції сполук у клітині, а також обміну енергією та інформацією, що при цьому відбувається. Так на стику цих біологічних дисциплін з хімією та фізикою виникла зовсім нова галузь – молекулярна біологія.

На відміну від біохімії, увага сучасної молекулярної біології зосереджена переважно на вивченні структури та функції найважливіших класів біополімерів – білків та нуклеїнових кислот, перші з яких визначають саму можливість протікання обмінних реакцій, а другі – біосинтез специфічних білків. Зрозуміло тому, що чітке розмежування молекулярної біології та біохімії, відповідних розділів генетики, мікробіології та вірусології неможливо.

Виникнення молекулярної біології було тісно пов'язане з розробкою нових методів дослідження, про які вже йшлося у відповідних розділах. Поряд із розвитком електронної мікроскопії та інших методів мікроскопічної техніки велику роль відіграли розроблені у 50-х роках методи фракціонування клітинних елементів. Вони ґрунтувалися на вдосконалених методах диференціального центрифугування(А. Клод, 1954). До цього часу вже були досить надійні способи виділення та фракціонування біополімерів. Сюди належить, зокрема, запропонований А. Тизеліусом (1937; Нобелівська премія, 1948) метод фракціонування білків за допомогою електрофорезу, методи виділення та очищення нуклеїнових кислот (Е. Кей, А. Даунс, М. Севаг, А. Мирський та ін). Паралельно у багатьох лабораторіях світу розроблялися різні методи хроматографічного аналізу (А. Мартін та Р. Сінг, 1941; Нобелівська премія, 1952), згодом суттєво вдосконалені.

Неоціненну послугу у розшифруванні структури біополімерів зіграв рентгеноструктурний аналіз. Основні принципи рентгеноструктурного аналізу було розроблено у Королівському коледжі Лондонського університету під керівництвом У. Брегга групою дослідників, куди входили Дж. Бернал, А. Лондсдейл, У. Астбері, Дж. Робертсон та інших.

Слід особливо відзначити дослідження професора Московського державного університетуА. Р. Кізеля з біохімії протоплазми (1925 - 1929), що мали найважливіше значення для подальшого становлення молекулярної біології. Кізель завдав удару міцно укоріненому уявленню, що в основі будь-якої протоплазми лежить особливе білкове тіло - пластин, що нібито визначає всі її найважливіші структурні і функціональні особливості. Він показав, що пластин - це білок, який зустрічається тільки у міксоміцетів, і то на певній стадії розвитку, і що жодного постійного компонента - єдиного скелетного білка - у протоплазмі немає. Тим самим було вивчення проблеми будови протоплазми та функціональної ролі білків вийшло на правильний шлях і одержало простір для свого розвитку. Дослідження Кізеля здобули світове визнання, стимулювавши вивчення хімії складових частинклітини.

Термін "молекулярна біологія", вперше використаний англійським кристалографом професором Лідського університету У. Астбері, з'явився, ймовірно, на початку 40-х (до 1945 р.). Основні рентгеноструктурні дослідження білків і ДНК, проведені Астбері в 30-х роках, послужили основою для подальшого успішного розшифрування вторинної структури цих біополімерів. У 1963 р. Дж. Бернал писав: "Пам'ятник йому буде встановлено всією молекулярною біологією - наукою, яку він назвав і справді заснував" * , У літературі цей термін з'явився вперше, мабуть, у 1946 р. у статті У. Астбері "Прогрес рентгеноструктурного" аналізу органічних та фібрилярних сполук", опублікованої в англійському журналі "Природа"**. У своїй Гарвіївській лекції Астбері (1950) відзначав: "Мені приємно, що зараз термін молекулярна біологія вже досить широко вживається, хоча мало ймовірно, що я першим запропонував його. Він мені подобався і я вже давно намагався його поширювати". Вже 1950 р. Астбері було ясно, що молекулярна біологія має справу насамперед із структурою і конформацією макромолекул, вивчення яких має вирішальне значення розуміння функціонування живих організмів.

* (Biogr. Mem. Fellows Roy. Soc, 1963, v. 9, 29.)

** (W. T. Astbury. Progress of X-ray analysis of organic and fibre structures.- Nature,. 1946, v. 157, 121.)

*** (W. T. Astbury. Adventures in Molecular Biology. Thomas Springfield, 1952, p. 3.)

Перед молекулярною біологією стояли і стоять, власне, самі завдання, як і перед усією біологією загалом,- пізнання сутності життя та її основних явищ, зокрема таких, як спадковість і мінливість. Сучасна молекулярна біологія в першу чергу покликана розшифрувати структуру та функцію генів, шляхи та механізми реалізації генетичної інформаціїорганізмів на різних стадіях онтогенезу та на різних етапахїї зчитування. Вона покликана розкрити тонкі механізми регуляції активності генів та клітинного диференціювання, з'ясувати природу мутагенезу та молекулярні основиеволюційного процесу.

Встановлення генетичної ролі нуклеїнових кислот

Для становлення молекулярної біології найбільше значеннямали такі відкриття. У 1944 р. американські дослідники О. Евері, К. Мак-Леод (Нобелевська премія, 1923) і М. Мак-Карті показали, що виділені з пневмококів молекули ДНК мають трансформуючу активність. Після гідролізу цих ДНК дезоксирибонуклеазою їхня трансформуюча активність повністю зникала. Тим самим було вперше було переконливо доведено, що генетичними функціями у клітині наділена саме ДНК, а чи не білок.

Заради справедливості слід зазначити, що явище бактеріальної трансформації було виявлено значно раніше відкриття Евері, Мак-Леода та Мак-Карті. У 1928 р. Ф. Гріффіт опублікував статтю, в якій повідомив, що після додавання до невірулентних (некапсульованих) пневмококів вбитих клітин капсулированного вірулентного штаму одержувана суміш клітин стає згубною для мишей. Більше того, живі клітини пневмококів, що виділяються із заражених цією сумішшю тварин, були вже вірулентними і мали полісахаридну капсулу. Тим самим у цьому досвіді було показано, що під впливом якихось компонентів убитих клітин пневмококів некапсульована форма бактерій перетворюється на капсулоутворюючу вірулентну форму. Через 16 років Евері, Мак-Леод і Мак-Карті замінили в цьому досвіді вбиті цілі клітини пневмококів їх дезоксирибонуклеїновою кислотою і показали, що саме ДНК має трансформуючу активність (див. також глави 7 і 25). Значення цього відкриття важко переоцінити. Воно стимулювало вивчення нуклеїнових кислот у багатьох лабораторіях світу та змусило сконцентрувати увагу вчених саме на ДНК.

Поруч із відкриттям Эвери, Мак-Леода і Мак-Карти на початку 50-х вже накопичилося досить багато прямих і непрямих даних у тому, що нуклеїнові кислоти грають виняткову роль життєдіяльності і несуть генетичну функцію. На це, зокрема, вказував і характер локалізації ДНК у клітині та дані Р. Вендрелі (1948) про те, що вміст ДНК на клітину строго постійно і корелює зі ступенем плідності: у гаплоїдних статевих клітинах ДНК вдвічі менше, ніж у диплоїдних соматичних. На користь генетичної ролі ДНК свідчила також її виражена метаболічна стабільність. До початку 50-х років накопичилося багато різноманітних фактів, що свідчили про те, що більшість відомих мутагенних факторів діють переважно на нуклеїнові кислоти і особливо на ДНК (Р. Хочкісс, 1949; Г. Ефруссі-Тейлор, 1951; Е. Фріз , 1957 та ін.).

Особливого значення у встановленні генетичної ролі нуклеїнових кислот мало вивчення різних фагів та вірусів. У 1933 р. Д. Шлезінгер знайшов ДНК у бактеріофазі кишкової палички. З моменту виділення У. Стенлі (1935, Нобелівська премія, 1946) вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ) у кристалічному стані розпочався новий етап у вивченні рослинних вірусів. У 1937 - 1938 роках. Співробітники Ротамстедської сільськогосподарської станції (Англія) Ф. Боуден і Н. Пірі показали, що багато виділених ними рослинних вірусів є не глобулінами, а являють собою рибонуклеопротеїди і містять як обов'язковий компонент нуклеїнову кислоту. На самому початку 40-х років були опубліковані роботи Г. Шрамма (1940), П. А. Агатова (1941), Г. Міллера та У. Стенлі (1941), які свідчили про те, що помітна хімічна модифікація білкового компонента не призводить до втрати інфекційності ВТМ. Це вказувало на те, що білковий компонент не може бути носієм спадкових властивостей вірусу, як продовжували вважати багато мікробіологів. Переконливі докази на користь генетичної ролі нуклеїнової кислоти (РНК) у рослинних вірусів були отримані у 1956 р. Г. Шраммом у Тюбінгені (ФРН) та X. Френкель-Конратом у Каліфорнії (США). Ці дослідники практично одночасно і незалежно один від одного виділили з ВТМ РНК і показали, що саме вона, а не білок, має інфекційність: внаслідок зараження рослин тютюну цієї РНК у них відбувалося формування та розмноження нормальних вірусних частинок. Це означало, що РНК містить інформацію для синтезу та збирання всіх вірусних компонентів, у тому числі і вірусного білка. У 1968 р. І. Г. Атабеков встановив, що білок грає істотну рольпри зараженні рослин - природою білка визначається спектр рослин-господарів.

У 1957 р. Френкель-Конрат вперше здійснив реконструкцію ВТМ із складових його компонентів – РНК та білка. Поряд із нормальними частинками він отримав змішані "гібриди", у яких РНК була від одного штаму, а білок - від іншого. Спадковість таких гібридів повністю визначалася РНК, і потомство вірусів належало до того штаму, РНК якого було використано отримання вихідних змішаних частинок. Пізніше досліди А. Гірера, Г. Шустера та Г. Шрамма (1958) та Г. Вітмана (1960 – 1966) показали, що хімічна модифікація нуклеїнового компонента ВТМ призводить до появи різноманітних мутантів цього вірусу.

У 1970 р. Д. Балтімор та Г. Темін встановили, що перенесення генетичної інформації може відбуватися не тільки від ДНК до РНК, а й навпаки. Вони виявили у деяких онкогенних РНК-вірусів (онкорнавіруси) особливий фермент, так звану зворотну транскриптазу, який здатний на ланцюгах РНК комплементарно синтезувати ДНК. Це велике відкриття дозволило зрозуміти механізм вбудовування в геном господаря генетичної інформації РНК-вірусів і по-новому поглянути на природу їх онкогенної дії.

Відкриття нуклеїнових кислот та вивчення їх властивостей

Термін нуклеїнових кислот був введений німецьким біохіміком Р. Альтманом в 1889 р., після того, як ці сполуки були відкриті в 1869 р. швейцарським лікарем Ф. Мішером. Мішер екстрагував клітини гною розведеної соляною кислотоюпротягом кількох тижнів і одержав у залишку майже чистий ядерний матеріал. Цей матеріал він вважав характерною речовиною клітинних ядер і назвав його нуклеїном. За своїми властивостями нуклеїн різко відрізнявся від білків: він був більш кислим, не містив сірку, зате в ньому було багато фосфору, він добре розчинявся в лугах, але не розчинявся в розведених кислот.

Результати своїх спостережень над нуклеїном Мішер направив Гоппе-Зейлеру для опублікування в журналі. Описана ним речовина була настільки незвичайною (тоді з усіх біологічних сполук фосфору був відомий тільки лецитин), що Гоппе-Зейлер не повірив досвідам Мішера, повернув йому рукопис і доручив своїм співробітникам М. Плошу та М. Любавіну перевірити його висновки на іншому матеріалі. . Робота Мішера "Про хімічний склад клітин гною" побачила світ на два роки пізніше (1871). У той же час були опубліковані роботи Гоппе-Зейлера та його співробітників щодо складу клітин гною, еритроцитів птахів, змій та інших клітин. Протягом наступних трьох років нуклеїн був виділений із тварин клітин та дріжджів.

У своїй роботі Мішер зазначав, що детальне вивчення різних нуклеїнів може призвести до встановлення відмінностей між ними, передбачивши цим ідею специфічності нуклеїнових кислот. Досліджуючи молоко лосося, Мішер встановив, що нуклеїн знаходиться в них у вигляді солі і пов'язаний з основним білком, який він назвав протаміном.

У 1879 р. в лабораторії Гоппе-Зейлер вивченням нуклеїнів почав займатися А. Коссель. У 1881 р. він виділив з нуклеїну гіпоксантин, проте на той час він ще сумнівався у походженні цієї основи і вважав, що гіпоксантин може бути продуктом деградації білків. У 1891 р. у числі продуктів гідролізу нуклеїну Коссель виявив аденін, гуанін, фосфорну кислоту та ще одну речовину із властивостями цукру. За дослідження з хімії нуклеїнових кислот Косселя у 1910 р. було присуджено Нобелівську премію.

Подальші успіхи у розшифровці структури нуклеїнових кислот пов'язані з дослідженнями П. Левіна та співробітників (1911 – 1934). У 1911 р. П. Левін та В. Жакобс ідентифікували вуглеводний компонент аденозину та гуанозину; вони встановили, що до цих нуклеозидів входить D-рибоза. У 1930 р. Левін показав, що вуглеводним компонентом дезоксирибонуклеозидів є 2-дезокси-D-рибоза. З його робіт стало відомо, що нуклеїнові кислоти побудовані з нуклеотидів, тобто фосфорильованих нуклеозидів. Левін вважав, що основним типом зв'язку в нуклеїнових кислотах (РНК) є 2", 5"-фосфодіефірний зв'язок. Це уявлення виявилося помилковим. Завдяки роботам англійського хіміка А. Тодда (Нобелевська премія, 1957) та його співробітників, а також англійських біохіміків Р. Маркхема та Дж. Сміта на початку 50-х років стало відомо, що основним типом зв'язку в РНК є 3", 5"- фосфодіефірний зв'язок.

Левін показав, що різні нуклеїнові кислоти можуть відрізнятися за природою вуглеводного компонента: одні містять цукор дезоксирибозу, інші - рибозу. Крім того, зазначені два типи нуклеїнових кислот відрізнялися за природою однієї з основ: у нуклеїнових кислотах пентозного типу містився урацил, а в нуклеїнових кислотах дезоксипентозного типу – тімін. Дезоксипентозну нуклеїнову кислоту (за сучасною термінологією, дезоксирибонуклеїнова кислота – ДНК) зазвичай легко виділяли у великих кількостях з тимусу (зобної залози) телят. Тому вона отримала назву тимонуклеїнової кислоти. Джерелом нуклеїнової кислоти пентозного типу (РНК) служили головним чином дріжджі та зародки пшениці. Цей тип часто називали дріжджовою нуклеїновою кислотою.

На початку 30-х років досить міцно вкоренилося уявлення, ніби рослинних клітин характерна нуклеїнова кислота дріжджового типу, а тимонуклеинова кислота властива лише ядрам тварин клітин. Два типи нуклеїнових кислот - РНК і ДНК - тоді називали відповідно рослинної і тваринної нуклеїновими кислотами. Однак, як показали ранні дослідження А. Н. Білозерського, такий поділ нуклеїнових кислот невиправданий. У 1934 р. Білозерський вперше виявив тимонуклеїнову кислоту в рослинних клітинах: з проростків гороху він виділив та ідентифікував тимін-піримідинову основу, характерну саме для ДНК. Потім він виявив тімін і в інших рослинах (насінні сої, квасолі). У 1936 р. А. Н. Білозерський та І. І. Дубровська виділили препаративно ДНК із проростків кінського каштану. Крім того, серія робіт, виконаних у 40-х роках в Англії Д. Девідсоном зі співробітниками, переконливо показала, що рослинна нуклеїнова кислота (РНК) міститься у багатьох тваринних клітинах.

Широке застосування розробленої Р. Фельгеном і Р. Розенбеком (1924) цитохімічної реакцію ДНК і реакції Ж. Браше (1944) на РНК дозволило досить швидко і однозначно вирішити питання переважної локалізації цих нуклеїнових кислот у клітині. Виявилося, що ДНК зосереджена в ядрі, тоді як РНК концентрується переважно в цитоплазмі. Пізніше було з'ясовано, що РНК міститься як у цитоплазмі, так і в ядрі, крім того, були виявлені цитоплазматичні ДНК.

Що стосується питання про первинну структуру нуклеїнових кислот, то до середини 40-х років у науці міцно утвердилося уявлення П. Левіна, згідно з яким усі нуклеїнові кислоти побудовані за одним типом і складаються з однакових так званих тетрануклеотидних блоків. У кожному з цих блоків, на думку Левіна, міститься чотири різні нуклеотиди. Тетрануклеотидна теорія будови нуклеїнових кислот значною мірою позбавляла ці біополімери специфічності. Тому не дивно, що всю специфіку живого пов'язували тоді лише з білками, природа мономерів яких набагато різноманітніша (20 амінокислот).

Першу пролом теоренуклеотидного будови нуклеїнових кислот пробили аналітичні дані англійського хіміка Дж. Гуланда (1945 - 1947). При визначенні складу нуклеїнових кислот азоту підстав він не отримав еквімолярного співвідношення підстав, як це мало б бути згідно з теорією Левіна. Остаточно тетрануклеотидна теорія будови нуклеїнових кислот впала в результаті досліджень Е. Чаргаффа та його співробітників (1949 – 1951). Для поділу основ, що вищеплюються з ДНК в результаті її кислотного гідролізу, Чаргафф використовував хроматографію на папері. Кожна з цих підстав була точно визначена спектрофотометрично. Чаргафф помітив значні відхилення від еквімолярного співвідношення підстав у ДНК різного походження і вперше виразно заявив, що ДНК має виражену видову специфічність. Тим самим було покладено край гегемонії концепції про специфічність білка в живій клітині. Аналізуючи ДНК різного походження, Чаргафф відкрив і сформулював унікальні закономірності складу ДНК, що увійшли до науки під назвою правил Чаргаффа. Згідно з цими правилами, у всіх ДНК, незалежно від походження, кількість аденіну дорівнює кількості тиміну (А = Т), кількість гуаніну дорівнює кількості цитозину (Г = Ц), кількість пуринів дорівнює кількості піримідинів (Г + А = Ц + Т), кількість основ з 6-аміногрупами дорівнює кількості основ з 6-кетогруп-пами (А+Ц=Г+Т). Разом про те, попри такі суворі кількісні відповідності, ДНК різних видів відрізняються за величиною відношення А+Т:Г+Ц. В одних ДНК кількість гуаніну та цитозину переважає над кількістю аденіну та тиміну (ці ДНК Чаргафф назвав ДНК ГЦ-типу); інші ДНК містили аденіну та тиміну більше, ніж гуаніну та цитозину (ці ДНК були названі ДНК АТ-типу). Отримані Чаргаффом дані щодо складу ДНК зіграли виняткову роль молекулярної біології. Саме вони лягли в основу відкриття будови ДНК, зробленої в 1953 Дж. Вотсоном і Ф. Криком.

Ще в 1938 р. У. Астбері та Ф. Белл за допомогою рентгеноструктурного аналізу показали, що площини основ у ДНК повинні бути перпендикулярними до довгої осі молекули і нагадувати як би стопку пластин, що лежать один над одним. У міру вдосконалення техніки рентгеноструктурного аналізу до 1952 – 1953 р.р. накопичилися відомості, що дозволили судити про довжину окремих зв'язків та кутах нахилу. Це дозволило з найбільшою ймовірністю уявити характер орієнтації кілець пентозних залишків в сахарофосфатном кістяку молекули ДНК. У 1952 р. С. Фарберг запропонував дві умоглядні моделі ДНК, які представляли складену або закручену саму на себе одноважну молекулу. Не менш спекулятивна модель будови ДНК була запропонована у 1953 р. Л. Полінгом (лауреат Нобелівської премії, 1954) та Р. Корі. У цій моделі три закручені ланцюги ДНК утворювали довгу спіраль, стрижень якої був представлений фосфатними групами, а основи розташовувалися назовні від нього. До 1953 р. М. Вілкінс та Р. Франклін отримали більш чіткі рентгеноструктурні картини ДНК. Їхній аналіз показав повну неспроможність моделей Фарберга, Полінга та Корі. Використовуючи дані Чаргаффа, зіставляючи різні поєднання молекулярних моделей окремих мономерів та дані рентгеноструктурного аналізу, Дж. Вотсон та Ф. Крик у 1953 р. дійшли висновку, що молекула ДНК має бути двотяжкою спіраллю. Правила Чаргаффа різко обмежили кількість можливих упорядкованих поєднань основ у запропонованій моделі ДНК; вони підказали Вотсону і Крику, що у молекулі ДНК має бути специфічне парування підстав - аденіну з тиміном, а гуаніну з цитозином. Іншими словами аденіну в одному ланцюзі ДНК завжди строго відповідає тимін в іншому ланцюзі, а гуаніну в одному ланцюзі обов'язково відповідає цитозин в іншій. Тим самим Уотсон і Крик вперше сформулювали виняткову важливість принцип комплементарної будови ДНК, згідно з яким один ланцюг ДНК доповнює іншу, тобто послідовність основ одного ланцюга однозначно визначає послідовність основ в іншому (комплементарному) ланцюзі. Стало очевидним, що вже в самій структурі ДНК закладено потенційну можливість її точного відтворення. Ця модель будови ДНК нині є загальновизнаною. За розшифрування структури ДНК Крику, Вотсону та Уїлкінсу в 1962 р. було присуджено Нобелівську премію.

Слід зазначити, що ідея про механізм точного відтворення макромолекул та передачу спадкової інформації зародилася в нашій країні. У 1927 р. Н. К. Кольцов висловив припущення, що при розмноженні клітин відбувається репродукція молекул шляхом точного автокаталітичного відтворення наявних материнських молекул. Щоправда, тоді Кольцов наділяв цим властивістю не молекули ДНК, а молекули білкової природи, про функціональному значенні яких тоді нічого не було відомо. Проте сама думка про автокаталітичне відтворення макромолекул та механізм передачі спадкових властивостей виявилася пророчою: вона стала керівною ідеєю сучасної молекулярної біології.

Проведені в лабораторії А. Н. Білозерського А. С. Спіріним, Г. Н. Зайцевою, Б. Ф. Ванюшиним, С. О. Урисон, А. С. Антоновим та іншими багаторічними дослідженнями (1957-1974) складу ДНК у самих різноманітних організмів повністю підтвердили закономірності, виявлені Чаргаффом, і повну відповідність до молекулярної моделі ДНК, запропонованої Уотсоном і Криком. Ці дослідження показали, що ДНК різних бактерій, грибів, водоростей, актиноміцетів, вищих рослин, безхребетних і хребетних мають специфічність складу. Особливо різко відмінності у складі (змісті АТ-пар основ) виражені у мікроорганізмів, виявляючись важливою таксономічною ознакою. У вищих рослин та тварин видові варіації у складі ДНК виражені значно слабше. Але це зовсім не означає, що ДНК у них менш специфічна. Крім складу підстав специфічність переважно визначається їх послідовністю в ланцюгах ДНК.

Поряд із звичайними основами у складі ДНК та РНК були виявлені додаткові азотисті основи. Так, у складі ДНК рослин і тварин Г. Уайт (1950) знайшов 5-метилцитозин, а Д. Данн та Дж. Сміт (1958) виявили в деяких ДНК метильований аденін. Довгий час метилцитозин вважався відмінністю генетичного матеріалу вищих організмів. У 1968 р. А. Н. Білозерський, Б. Ф. Ванюшин та Н. А. Кокуріна встановили, що він може зустрічатися також і в ДНК бактерій.

У 1964 р. М. Голд та Дж. Хурвітц відкрили новий клас ферментів, що здійснюють природну модифікацію ДНК – її метилювання. Після цього відкриття стало ясно, що мінорні (що містяться в малих кількостях) основи виникають вже на готовому полінуклеотидному ланцюзі ДНК в результаті специфічного метилювання залишків цитозину та аденіну в особливих послідовностях. Зокрема, за даними Б. Ф. Ванюшина, Я. І. Бур'янова та А. Н. Білозерського (1969) метилювання аденіну в ДНК кишкової палички може відбуватися в термінуючих кодонах. За даними А. Н. Білозерського та співробітників (1968 - 1970), а також М. Мезельсона (США) та В. Арбера (Швейцарія) (1965 - 1969) метилювання надає молекулам ДНК унікальні індивідуальні риси і в поєднанні з дією специфічних нуклеаз є частиною складного механізму, який здійснює контроль за синтезом ДНК у клітині. Іншими словами, характер метилювання тієї чи іншої ДНК визначає питання про те, чи може вона розмножуватися у цій клітині.

Практично в той же час почалося виділення та інтенсивне вивчення ДНК-метилаз та рестрикуючих ендонуклеаз; 1969 - 1975 рр. встановлені нуклеотидні послідовності, відомі в ДНК деякими з цих ферментів (X. Бойєр, X. Сміт, С. Лінн, К. Муррей). При гідролізі різних ДНК ферментом, що рестрикує, вищеплюються досить великі фрагменти з однаковими "липкими" кінцями. Це дає можливість як аналізувати структуру генів, як і зроблено в невеликих вірусів (Д. Натанс, З. Адлер, 1973 - 1975), а й конструювати різні геноми. З відкриттям цих специфічних ферментів рестрикції генетична інженерія стала відчутною реальністю. Вбудовані в невеликі плазмідні ДНК гени різного походження легко вводять у різні клітини. Так, отримано новий тип біологічно активних плазмід, що дають стійкість до деяких антибіотиків (С. Коен, 1973), введені рибосомальні гени жаби та дрозофіли в плазміди кишкової палички (Дж. Морроу, 1974; X. Бойєр, Д. Хогнесс, Р. , 1974 – 1975). Таким чином, відкриті реальні шляхи для отримання принципово нових організмів шляхом введення та вбудовування у їх генофонд різноманітних генів. Це відкриття може бути спрямоване на благо людства.

У 1952 р. Г. Уайт та С. Коен виявили, що в ДНК Т-парних фагів міститься незвичайна основа - 5-оксиметилцитозин. Пізніше з робіт Е. Волькіна і Р. Сінсхеймера (1954) та Коена (1956) стало відомо, що залишки оксиметилцитозину можуть бути повністю або частково глюкозидовані, внаслідок чого молекула фагової ДНК виявляється захищеною від гідролітичної дії нуклеаз.

На початку 50-х років із робіт Д. Данна та Дж. Сміта (Англія), С. Заменхофа (США) та А. Вакера (ФРН) стало відомо, що в ДНК можуть включатися багато штучних аналогів основ, заміщаючи іноді до 50% тиміну. Як правило, ці заміщення призводять до помилок при реплікації, транскрипції ДНК та трансляції та до появи мутантів. Так, Дж. Мармур (1962) встановив, що ДНК деяких фагів замість тиміну міститься оксиметилурацил. У 1963 р. І. Такахаші та Дж. Мармур виявили, що в ДНК одного з фагів замість тиміну міститься урацил. Таким чином, звалився ще один принцип, яким раніше розділяли нуклеїнові кислоти. З часів робіт П. Левіна вважалося, що характерною ознакою ДНК є тімін, а РНК – урацил. Стало ясно, що ця ознака не завжди надійна, і важливою відмінністю хімічної природи двох типів нуклеїнових кислот, як це представляється на сьогоднішній день, є лише характер вуглеводного компонента.

Під час вивчення фагів було розкрито багато незвичайних ознак організації нуклеїнових кислот. З 1953 р. вважалося, що це ДНК є двотяжкі лінійні молекули, а РНК - лише однотяжні. Це становище суттєво похитнулося в 1961 р., коли Р. Сінсхеймер виявив, що ДНК фага φ X 174 представлена ​​однотяжкою кільцевою молекулою. Щоправда, потім з'ясувалося, що у такій формі ця ДНК існує лише у вегетативної фагової частки, а реплікативна форма ДНК цього фага також двотяжка. Крім того, дуже несподіваним виявилося, що РНК деяких вірусів може бути двотяжкою. Цей новий тип макро молекулярної організаціїРНК був виявлений у 1962 р. П. Гоматосом, І. Таммом та іншими дослідниками у деяких вірусів тварин та у вірусу ранової пухлини рослин. Нещодавно В. І. Агол і А. А. Богданов (1970) встановили, що крім лінійних молекул РНК існують замкнуті або циклічні молекули. Циклічна двотяжка РНК виявлена ​​ними, зокрема, у вірусу енцефаломієлокардиту. Завдяки роботам X. Діво, Л. Тіноко, Т. І. Тихоненка, Е. І. Будовського та інших (1960 – 1974) стали відомі основні риси організації (укладання) генетичного матеріалу у бактеріофагів.

Наприкінці 50-х років американський вчений П. Доті встановив, що при нагріванні відбувається денатурація ДНК, що супроводжується розривом водневих зв'язків між парами основ та розбіжністю комплементарних ланцюгів. Цей процес має характер фазового переходуза типом "спіраль-клубок" і нагадує плавлення кристалів. Тому процес теплової денатурації ДНК Доті назвав плавленням ДНК. При повільному охолодженні відбувається ренатурацпя молекул, тобто возз'єднання комплементарних половинок.

Принцип ренатурації в 1960 р. був використаний Дж. Мармуром і К. Шільдкраутом для визначення ступеня "гібридизування" ДНК різних мікроорганізмів. Згодом Е. Болтон та Б. Мак-Карті удосконалили цей прийом, запропонувавши метод так званих ДНК-агарових колонок. Цей метод виявився незамінним у вивченні ступеня гомології нуклеотидної послідовності різних ДНК та з'ясуванні генетичної спорідненості різних організмів. Відкрита Доти денатурація ДНК у поєднанні з описаною Дж. Манделем та А. Херши* (1960) хроматографією на метильованому альбуміні та центрифугуванням у градієнті щільності (метод розроблений у 1957 р. М. Мезельсоном, Ф. Сталем та Д. Виноградом) розділення, виділення та аналізу окремих комплементарних ланцюгів ДНК Так, наприклад, В. Шибальськи (США), використовуючи ці прийоми для поділу ДНК лямбда фага, показав у 1967 - 1969 рр., що генетично активними є обидва ланцюжки фага, а не один, як це було прийнято рахувати (С. Спігельман, 1961). Слід зазначити, що вперше ідея про генетичну значущість обох ланцюжків ДНК лямбда фага була висловлена ​​в СРСР С. Є. Бреслером (1961).

* (За роботи з генетики бактерій та вірусів А. Херші спільно з М. Дельбрюком та С. Луріа були удостоєні 1969 р. Нобелівської премії.)

Для розуміння організації та функціональної активності геному першорядне значення має визначення нуклеотидної послідовності ДНК. Пошуки методів такого визначення ведуться у багатьох лабораторіях світу. У США М. Бір із співробітниками з кінця 50-х років намагається встановити послідовність ДНК за допомогою електронної мікроскопії, але поки що безуспішно. На початку 50-х років із перших робіт Сінсхеймера, Чаргаффа та інших дослідників з ферментативної деградації ДНК стало відомо, що різні нуклеотиди в молекулі ДНК розподілені хоч і нехаотично, але нерівномірно. За даними англійського хіміка К. Бартона (1961), піримідини (їх понад 70%) зосереджені переважно у вигляді відповідних блоків. А. Л. Мазін і Б. Ф. Ванюшин (1968 - 1969) встановили, що різні ДНК мають різний ступінь зблоченості піримідинів і що в ДНК тварин організмів вона помітно зростає в міру переходу від нижчих до вищих. Отже, еволюція організмів відбито у структурі їх геномів. Саме тому для розуміння еволюційного процесу в цілому порівняльне вивчення структури нуклеїнових кислот набуває особливого значення. Аналіз структури біологічно важливих полімерів і насамперед ДНК вкрай важливий і для вирішення багатьох приватних питань філогенетики та таксономії.

Цікаво відзначити, що англійський фізіолог Е. Ланкестер, який вивчав гемоглобіни молюсків, що рівно 100 років тому передбачив ідеї молекулярної біології, писав: "Хімічні відмінності різних видів і пологів тварин і рослин мають таке ж важливе значення для з'ясування історії їх походження, як і відмінності в їхній формі.Якби ми могли чітко встановлювати відмінності в молекулярній організації та функціонуванні організмів, ми змогли б значно краще розібратися в походження та еволюції різних організмів, ніж на підставі морфологічних спостережень"*. Значимість біохімічних досліджень для систематики підкреслював і В. Л. Комаров, який писав, що "в основі всіх чисто морфологічних ознак, на підставі яких ми класифікуємо і встановлюємо види, лежать саме біохімічні відмінності" ** .

* (Е. R. Lankester. Uber das Vorcommen von Haemoglobin в днині Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben в дн lebendigen Organismen.)

** (В. Л. Комаров. Вибрані соч., т. 1. М.-Л., Вид-во АН СРСР, 1945, стор 331.)

А. В. Благовіщенський і С. Л. Іванов ще в 20-х роках зробили перші в нашій країні кроки щодо з'ясування деяких питань еволюції та систематики організмів на основі порівняльного аналізу їхнього біохімічного складу (див. гл. 2). Порівняльний аналізструктури білків і нуклеїнових кислот в даний час стає все більш відчутною підмогою для систематиків (див. Розділ 21). Цей метод молекулярної біології дозволяє як уточнити становище окремих видів у системі, а й змушує по-новому поглянути самі принципи класифікації організмів, котрий іноді переглянути всю систему загалом, як і сталося, наприклад, із систематикою мікроорганізмів. Безперечно, і в майбутньому аналіз структури геному займатиме центральне місце в хемосистематиці організмів.

Величезне значення для становлення молекулярної біології мало розшифрування механізмів реплікації ДНК та транскрипції (див. розділ 24).

Біосинтез білка

Важливе зрушення у вирішенні проблеми біосинтезу білка пов'язане з успіхами у вивченні нуклеїнових кислот. У 1941 р. Т. Касперсон (Швеція) та 1942 р. Ж. Браше (Бельгія) звернули увагу на те, що в тканинах з активним білковим синтезом міститься підвищена кількість РНК. Вони дійшли висновку, що рибонуклеїнові кислоти грають визначальну роль синтезі білка. У 1953 р. Е. Гейл і Д. Фокс, начебто, отримали прямі докази безпосередньої участі РНК у біосинтезі білка: за їхніми даними, рибонуклеаза значно пригнічувала включення амінокислот у лізатах бактеріальних клітин. Аналогічні дані були отримані В. Олфрі, М. Делі та А. Мирським (1953) на гомогенатах печінки. Пізніше Еге. Гейл відмовився від висловленої їм правильної ідеї про провідну роль РНК у білковому синтезі, помилково вважаючи, що активація білкового синтезу у безклітинній системі відбувалася під впливом якоїсь іншої речовини невідомої природи. У 1954 р. П. Замітник, Д. Літлфілд, Р. Б. Хесін-Лур'є та інші виявили, що найбільш активне включення амінокислот відбувається у багатих РНК фракціях субклітинних частинок – мікросом. П. Замітник та Е. Келлер (1953 – 1954) виявили, що включення амінокислот помітно посилювалося у присутності надосадової фракції в умовах регенерації АТФ. П. Сікевіц (1952) та М. Хогланд (1956) виділили з надосадової рідини білкову фракцію (рН 5 фракція), яка була відповідальною за різке стимулювання включення амінокислот у мікросомах. Поряд із білками в надосадовій рідині було виявлено особливий клас низькомолекулярних РНК, які тепер називають транспортними РНК (тРНК). У 1958 р. Хогланд і Помітник, і навіть П. Берг, Р. Світ і Ф. Аллен та ще дослідники виявили, що з активації кожної амінокислоти необхідний свій особливий фермент, АТФ і специфічна тРНК. Стало ясно, що тРНК виконують виключно функцію адаптерів, тобто пристосувань, які знаходять на нуклеїновій матриці (іРНК) місце відповідної амінокислоті у білковій молекулі, що формується. Ці дослідження повністю підтвердили адапторну гіпотезу Ф. Крику (1957), що передбачала існування в клітині полінуклеотидних адапторів, необхідних для правильного розташування амінокислотних залишків білка, що синтезується на нуклеїновій матриці. Вже набагато пізніше французький вчений Ф. Шапвіль (1962) в лабораторії Ф. Ліпмана (Нобелівська премія, 1953) у США дуже дотепно і однозначно показав, що місце розташування амінокислоти в білковій молекулі, що синтезується, повністю визначається тією специфічною тРНК, до якої вона приєднана. Адапторна гіпотеза Крику була розвинена у роботах Хогланда та Помічника.

До 1958 стали відомі такі основні етапи білкового синтезу: 1) активація амінокислоти специфічним ферментом з "рН 5 фракції" в присутності АТФ з утворенням аміноациладенілату; 2) приєднання активованої амінокислоти до специфічної тРНК із вивільненням аденозинмонофосфату (АМФ); 3) зв'язування аміноацил-тРНК (тРНК, навантажена амінокислотою) з мікросомами та включення амінокислот у білок з вивільненням тРНК. Хогланд (1958) зазначив, що на останньому етапі білкового синтезу необхідний гуанозінтріфосфат (ГТФ).

Транспортні РНК та синтез гена

Після виявлення тРНК почалися активні пошуки їхнього фракціонування та визначення нуклеотидної послідовності. Найбільших успіхів досяг американський біохімік Р. Холлі. У 1965 р. він встановив структуру аланінової тРНК із дріжджів. За допомогою рибонуклеаз (гуанілова РНК-аза та панкреатична РНК-аза) Холлі розділив молекулу нуклеїнової кислоти на кілька фрагментів, визначив у кожному окремо нуклеотидну послідовність і потім реконструював послідовність всієї молекули аланінової тРНК. Цей шлях аналізу нуклеотидної послідовності отримав назву блочного методу. Заслуга Холлі полягала головним чином тому, що він навчився розділяти молекулу РНК як на дрібні шматки, як і багато хто й до нього, а й у великі фрагменти (четвертинки і половинки). Це й дало можливість правильно зібрати окремі маленькі шматки воєдино і цим відтворити повну нуклеотидну послідовність всієї молекули тРНК (Нобелевская премія, 1968).

Цей прийом відразу ж було прийнято на озброєння у багатьох лабораторіях світу. Протягом наступних двох років у СРСР і за кордоном було розшифровано первинну структуру відразу кількох тРНК. А. А. Баєв (1967) та співробітники вперше встановили послідовність нуклеотидів у дріжджовій валіновій тРНК. На цей час вивчено вже понад десяток різних індивідуальних тРНК. Своєрідний рекорд у визначенні нуклеотидної послідовності встановлено у Кембриджі Ф. Сенгером та Г. Браунлі. Ці дослідники розробили напрочуд витончений метод поділу олігонуклеотидів і встановили послідовність так званої 5 S ​​(рибосомної) РНК із клітин кишкової палички (1968). Ця РНК складається з 120 нуклеотидних залишків і, на відміну від тРНК, не містить додаткових мінорних основ, які помітно полегшують аналіз нуклеотидної послідовності, служачи унікальними орієнтирами окремих фрагментів молекули. В даний час завдяки використанню методу Сенгера та Браунлі успішно просувається робота з вивчення послідовності довгих рибосомних РНК та деяких вірусних РНК у лабораторії Ж. Ебеля (Франція) та інших дослідників.

А. А. Баєв та співробітники (1967) виявили, що розрізана навпіл валінова тРНК відновлює свою макромолекулярну структуру в розчині і, незважаючи на дефект у первинній структурі, має функціональну активність вихідної (нативної) молекули. Цей підхід – реконструкція розрізаної макромолекули після видалення певних фрагментів – виявився досить перспективним. Він широко використовується зараз з'ясування функціональної ролі окремих ділянок тих чи інших тРНК.

У Останніми рокамидосягнуто великого успіху в отриманні кристалічних препаратів індивідуальних тРНК. Зараз у кількох лабораторіях у США та Англії вдалося закристалізувати вже багато тРНК. Це дало змогу дослідити стуруктуру тРНК за допомогою рентгеноструктурного аналізу. У 1970 р. Р. Бок представив перші рентгенограми та тривимірні моделі кількох тРНК, створені ним у Вісконсінському університеті. Ці моделі допомагають визначити локалізацію окремих функціонально активних ділянок у тРНК та зрозуміти основні засади функціонування цих молекул.

Найважливіше значення для розкриття механізму синтезу білка та вирішення проблеми специфічності цього процесу мало розшифровка природи генетичного коду (див. розділ 24), яку без перебільшення можна розглядати як провідне завоювання природознавства XX ст.

Розкриття Р. Холлі первинної структури тРНК дало поштовх роботам Г. Корани* (США) щодо синтезу олігонуклеотидів і направило їх на шлях синтезу певної біологічної структури – молекули ДНК, що кодує аланінову тРНК. Зроблені Кораною майже 15 років тому перші кроки щодо хімічного синтезу коротких олігонуклеотидів завершилися в 1970 р. вперше здійсненим синтезом гена. Корана та його співробітники спочатку з окремих нуклеотидів синтезували хімічним шляхом короткі фрагменти завдовжки 8-12 нуклеотидних залишків. Ці фрагменти із заданою нуклеотидною послідовністю утворювали спонтанно двотяжкі комплементарні шматки з перекриттям 4 - 5 нуклеотидів. Потім ці готові шматки в потрібному порядку по черзі з'єднували кінець кінець за допомогою ферменту ДНК-лігази. Таким чином, на відміну від реплікації молекул ДНК, за А. Корнбергом** (див. розділ 24), Корані вдалося заново створити молекулу природної двотяжкової ДНК за заздалегідь наміченою програмою відповідно до послідовності тРНК, описаної Холлі. Аналогічним чином зараз ведуться роботи з синтезу інших генів (М. Н. Колосов, 3. А. Шабарова, Д. Г. Кнорре, 1970 – 1975).

* (За дослідження генетичного коду Г. Корані та М. Ніренбергу було присуджено у 1968 р. Нобелівську премію.)

** (За відкриття полімерази та синтез ДНК А. Корнбергу, а за синтез РНК С. Очоа у 1959 р. було присуджено Нобелівську премію.)

Мікросоми, рибосоми, трансляція

У 1950-х років вважалося, що центром білкового синтезу у клітині є микросомы. Термін мікросоми був уперше введений у 1949 р. А. Клодом для позначення фракції дрібних гранул. Пізніше з'ясувалося, що за білковий синтез відповідальна не вся фракція мікросом, що складається з мембран та гранул, а лише дрібні рибонуклеопротеїдні частки. Ці частки у 1958 р. було названо Р. Робертсом рибосомами.

Класичні дослідження бактеріальних рибосом були проведені А. Тисьєром та Дж. Вотсоном у 1958 - 1959 рр. Бактеріальні рибосоми виявилися дещо дрібнішими від рослинних і тварин. Дж. Літлтон (1960), М. Кларк (1964) та Е. Н. Світайло (1966) показали, що рибосоми хлоропластів вищих рослин та мітохондрій належать до бактеріального типу. А. Тисьєр та інші (1958) виявили, що рибосоми дисоціюють на дві нерівні субодиниці, що містять по одній молекулі РНК. Наприкінці 50-х років вважалося, що кожна молекула рибосомної РНК складається з кількох коротких фрагментів. Однак А. С. Спірін у 1960 р. вперше показав, що РНК у субчастинках представлені безперервною молекулою. Д. Уоллер (1960), розділивши рибосомні білки за допомогою електрофорезу в крохмальному гелі, встановив, що вони гетерогенні. Спочатку багато хто сумнівався в даних Уоллера, оскільки здавалося, що білок рибосоми повинен бути суворо гомогенним, як, наприклад, білок ВТМ. В даний час в результаті досліджень Д. Уоллера, Р. Траута, П. Трауба та інших біохіміків стало відомо, що до складу власне рибосомних частинок входить більше 50 різних за структурою білків. А. С. Спіріну в 1963 р. вдалося вперше розгорнути рибосомні субчастинки і показати, що рибосоми являють собою компактно скручений рибонуклеопротеїдний тяж, який в певних умовах може розгортатися. У 1967 - 1968 р.р. М. Номура повністю реконструював біологічно активну субчастицю з рибосомної РНК та білка і навіть отримав такі рибосоми, у яких білок та РНК належали різним мікроорганізмам.

До сьогодні незрозуміла роль рибосомної РНК. Передбачається, що вона є унікальною специфічною матрицею, на якій при формуванні рибосомної частки знаходить строго певне місце кожен з численних рибосомних білків (А. С. Спірін, 1968).

А. Річ (1962) виявив агрегати з кількох рибосом, з'єднаних між собою ниткою іРНК. Ці комплекси було названо полісомами. Виявлення полісом дозволило Річу і Вотсону (1963) висловити припущення, що синтез поліпептидного ланцюга відбувається на рибосомі, яка ніби просувається ланцюжком іРНК. У міру просування рибосоми по ланцюжку іРНК в частинці здійснюється зчитування інформації та утворення поліпептидного ланцюга білка, а нові рибосоми по черзі приєднуються до прочитаного кінця іРНК, що вивільняється. З даних Річа та Уотсона випливало, що значення полісом у клітині полягає у масовій продукції білка шляхом послідовного прочитування матриці відразу кількома рибосомами.

В результаті досліджень М. Ніренберга, С. Очоа, Ф. Ліпмана, Г. Корани та інших у 1963 – 1970 pp. стало відомо, що поряд з іРНК, рибосомами, АТФ та аміноацил-тРНК у процесі трансляції бере участь велика кількість різноманітних факторів, а сам процес трансляції може бути умовно поділений на три етапи – ініціацію, власне трансляцію та термінацію.

Ініціація трансляції означає синтез першого пептидного зв'язку в комплексі рибосома – матричний полінуклеотид – аміноацил-тРНК. Таку ініціаторну активність має не всяка аміноацил-тРНК, а формілметіоніл-тРНК. Ця речовина була вперше виділена у 1964 р. Ф. Сенгером та К. Маркером. С. Бретчер і К. Маркер (1966) показали, що ініціаторна функція формілметіоніл-тРНК обумовлена ​​її підвищеною спорідненістю до пептидильного центру рибосоми. Для початку трансляції вкрай важливими є також деякі білкові фактори ініціації, які були виділені в лабораторіях С. Очоа, Ф. Гро та інших дослідницьких центрах. Після утворення першого пептидного зв'язку в рибосомі починається власне трансляція, тобто послідовне приєднання аміноацильного залишку до С-кінця поліпептиду. Багато деталей процесу трансляції вивчили К. Монро та Дж. Бішоп (Англія), І. Рихлік та Ф. Шорм (ЧССР), Ф. Ліпман, М. Бретчер, В. Гілберт (США) та інші дослідники. У 1968 р. А. С. Спірін пояснення механізму роботи рибосоми запропонував оригінальну гіпотезу. Привідним механізмом, що забезпечує всі просторові переміщення тРНК та іРНК під час трансляції, є періодичне розмикання та змикання субчастинок рибосоми. Закінчення трансляції закодовано в матриці, що зчитується, яка містить термінуючі кодони. Як показав С. Бреннер (1965 – 1967), такими кодонами є триплети УАА, УАГ та УГА. М. Капеччі (1967) виявив також спеціальні білкові фактори термінації. А. С. Спіріним та Л. П. Гаврилової описаний так званий "неферментативний" синтез білка в рибосомах (1972 - 1975) без участі білкових факторів. Це відкриття є важливим для розуміння походження та еволюції біосинтезу білка.

Регуляція активності генів та білків

Після проблеми специфічності білкового синтезу першому місці у молекулярної біології виявилася проблема регуляції синтезу білків, чи, що те саме, регуляції активності генів.

Функціональна нерівнозначність клітин та пов'язані з нею репресія та активація генів давно привертали увагу генетиків, але досі реальний механізм контролю генної активності залишався невідомим.

Перші спроби пояснити регуляторну активність генів пов'язані з вивченням гістонних білків. Ще подружжя Стедман на початку 40-х років XX ст. висловлювали думку, що саме гістони можуть грати у цьому явищі основну роль. Надалі вони отримали перші чіткі дані про відмінності у хімічній природі гістонних білків. В даний час кількість фактів, що свідчать на користь цієї гіпотези, з кожним роком зростає.

* (Е. Stedman, E. Stedman. The basic proteins of cell nuclei.- Phylosoph. Trans. Roy. Soc. London, 1951, v. 235, 565 – 595.)

У той же час накопичується все більша кількістьданих, які говорять, що регуляція генної активності - набагато складніший процес, ніж просте взаємодія ділянок генів з молекулами гістонних білків. У 1960 - 1962 р.р. в лабораторії Р. Б. Хесина-Лур'є було з'ясовано, що гени фагів починають зчитуватися неодночасно: гени фага Т2 можна поділити на ранні, функціонування яких відбувалося в перші хвилини зараження бактеріальної клітини, і пізні, що починали синтезувати іРНК після завершення ранніх генів.

У 1961 р. французькі біохіміки Ф. Жакоб і Ж. Моно запропонували схему регулювання активності генів, яка відіграла виняткову роль у розумінні регуляторних механізмів клітини взагалі. Згідно зі схемою Жакоба і Моно, у ДНК крім структурних (інформаційних) генів є ще гени-регулятори та гени-оператори. Ген-регулятор кодує синтез специфічної речовини - репресора, який може приєднуватись як до індуктора, так і до гена-оператора. Ген-оператор зчеплений зі структурними генами, а ген-регулятор перебуває у певному віддаленні них. Якщо в середовищі немає індуктора, наприклад, лактози, то репресор, що синтезується геном-регулятором, зв'язується з геном-оператором і, блокуючи його, вимикає роботу всього оперону (блок структурних генів разом з керуючим ними оператором). Утворення ферменту цих умовах немає. Якщо ж середовищі з'являється індуктор (лактоза), то продукт гена-регулятора - репресор - зв'язується з лактозою і знімає блок з гена-оператора. У цьому випадку стає можливою робота структурного гена, що кодує синтез ферменту, і фермент (лактоза) утворюється в середовищі.

На думку Жакоба і Моно, ця схема регуляції може бути застосована до всіх адаптивних ферментів і може мати місце як при репресії, коли утворення ферменту пригнічується надлишком продукту реакції, так і при індукції, коли внесення субстрату викликає синтез ферменту. За дослідження регулювання активності генів Жакоб і Моно були удостоєні в 1965 р. Нобелівської премії.

Спочатку ця схема здавалася надто надуманою. Однак згодом з'ясувалося, що регуляція генів за цим принципом має місце не лише у бактерій, а й в інших організмів.

Починаючи з 1960 р. помітне місце в молекулярній біології займають дослідження організації геному і структури хроматину в еукаріотичних організмів (Дж. Боннер, Р. Бріттен, В. Олфрі, П. Уокер, Ю. С. Ченцов, І. Б. Збарський та ін. .) та з регуляції транскрипції (А. Мирський, Г. П. Георгієв, М. Бернстіл, Д. Голл, Р. Цанев, Р. І. Салганик). Довгий час залишалася невідомою та спірною природа репресора. У 1968 р. Пташне (США) показав, що репресором є білок. Він виділив його в лабораторії Дж. Вотсона і виявив, що репресор, дійсно, має спорідненість до індуктора (лактози) і одночасно "дізнається" ген-оператор лак-оперона і специфічно зв'язується з ним.

В останні 5 - 7 років отримані дані про наявність ще одного керуючого осередку генної активності - промотор. Виявилося, що по сусідству з операторною ділянкою, до якої приєднується продукт, синтезований на гені-регуляторі - білковій речовині репресора, є інша ділянка, яку слід віднести до членів регуляторної системи генної активності. До цієї ділянки приєднується білкова молекула ферменту РНК-полімерази. У промоторній ділянці має відбутися взаємне впізнавання унікальної послідовності нуклеотидів у ДНК та специфічної конфігурації білка РНК-полімерази. Від ефективності впізнавання залежатиме здійснення процесу зчитування генетичної інформації з даною послідовністю генів оперону, що примикає до промотор.

Крім описаної Жакобом і Моно схеми, у клітині існують інші механізми регуляції генів. Ф. Жакоб та С. Бреннер (1963) встановили, що регуляція реплікації бактеріальної ДНК певним чином контролюється клітинною мембраною. Досліди Жакоба (1954) з індукції різних профагів переконливо показали, що під впливом різних мутагенних факторів у клітині лізогенних бактерій починається вибіркова реплікація гена профагу, а реплікація геному господаря блокується. У 1970 р. Ф. Белл повідомив, що в цитоплазму з ядра можуть переходити невеликі молекули ДНК і вже там транскрибуватися.

Таким чином, регуляція активності генів може здійснюватися на рівні реплікації, транскрипції та трансляції.

Значних успіхів досягнуто у вивченні регуляції як синтезу ферментів, а й їх активності. На явища регуляції активності ферментів у клітині вказували ще у 50-х роках А. Новік та Л. Сциллард. Г. Умбаргер (1956) встановив, що у клітині існує дуже раціональний шлях придушення активності ферменту кінцевим продуктом ланцюга реакцій на кшталт зворотнього зв'язку. Як було встановлено Ж. Моно, Ж. Шанже, Ф. Жакобом, А. Парді та іншими дослідниками (1956 – 1960), регуляція активності ферментів може здійснюватися за алостеричним принципом. Фермент або одна з його субодиниць, крім спорідненості до субстрату, має спорідненість до одного з продуктів ланцюга реакцій. Під впливом такого продукту-сигналу фермент змінює свою конформацію, що втрачає активність. В результаті весь ланцюг ферментативних реакцій вимикається на самому початку. На суттєву роль конформаційних змін білка у ферментативних реакціях, а у певному сенсі і на наявність алостеричного ефекту, вказували Д. Вімен та Р. Вудворд (1952; лауреат Нобелівської премії, 1965).

Структура та функції білків

В результаті робіт Т. Осборна, Г. Гофмейстера, А. Гюрбера, Ф. Шульца та багатьох інших наприкінці ХІХ ст. було отримано багато тварин і рослинні білки в кристалічному вигляді. Приблизно в цей час за допомогою різних фізичних методівбули встановлені молекулярні ваги деяких білків. Так, у 1891 р. А. Сабанєєв та Н. Александров повідомили, що молекулярна вагаовальбуміну становить 14 000; 1905 р. Е. Рейд встановив, що молекулярна вага гемоглобіну дорівнює 48 000. Полімерна структурабілків була розкрита в 1871 р. Г. Глазівець і Д. Габерманом. Ідея про пептидний зв'язок окремих амінокислотних залишків у білках була висловлена ​​Т. Куртіусом (1883). Роботи з хімічної конденсації амінокислот (Е. Шаал, 1871; Г. Шифф, 1897; Л. Бальбіано та Д. Траскіатті, 1900) та синтезу гетерополіпептидів (Е. Фішер, 1902 - 1907, 1907, Нобелівська премія, 1 хімічної структурибілків.

Перший кристалічний фермент (уреаза) було отримано 1926 р. Дж. Самнером (Нобелівська премія, 1946), а 1930 р. Дж. Нортроп (Нобелівська премія, 1946) отримав кристалічний пепсин. Після цих робіт зрозуміли, що ферменти мають білкову природу. У 1940 р. М. Куніц виділив кристалічну РНК-азу. До 1958 вже було відомо більше 100 кристалічних ферментів і понад 500 ферментів, виділених у некристалічному вигляді. Отримання високоочищених препаратів індивідуальних білків сприяло розшифровці їхньої первинної структури та макромолекулярної організації.

Велике значення у розвиток молекулярної біології взагалі і генетики людини, особливо, мало відкриття Л. Полингом (1940) ненормального гемоглобіну S, виділеного з еритроцитів людей із тяжкою спадковою хворобою - серповидно-клітинної анемією. У 1955 - 1957 р.р. В. Інгрем використовував розроблений Ф. Сенгер метод "відбитків пальців" (плям, утворених окремими пептидами при хроматографії на папері) для аналізу продуктів гідролізу гемоглобіну S лугом і трипсином. У 1961 р. Інгрем повідомив, що гемоглобін S відрізняється від нормального гемоглобіну тільки за природою одного амінокислотного залишку: у нормальному гемоглобіні в сьомому положенні ланцюга знаходиться залишок глютамінової кислоти, а в гемоглобіні S - залишок валіну. Цим повністю підтвердилося (1949) припущення Полінга, що серповидно-клітинна анемія є хворобою молекулярної природи. Спадкова зміна всього одного залишку амінокислоти в кожній половинці макромолекули гемоглобіну призводить до того, що гемоглобін втрачає здатність легко розчинятися при низькій концентрації кисню і починає кристалізуватися, що призводить до порушення структури клітини. Ці дослідження з усією очевидністю показали, що структура білка є суворо певною амінокислотною послідовністю, яка закодована в геномі. Про виняткове значення первинної структури білка у формуванні унікальної біологічно активної конформації макромолекули свідчили роботи К. Анфінсена (1951). Анфінсен показав, що біологічно активна макроструктура панкреатичної рибонуклеази, що втрачається в результаті відновлення, зумовлена ​​амінокислотною послідовністю і може знову виникати спонтанно при окисленні SH-груп залишків цистеїну з утворенням дисульфідних зшивок у строго визначених місцях пептидного ланцюга ферменту.

На даний час детально вивчений механізм дії великої кількості ферментів та визначено структуру багатьох білків.

У 1953 р. Ф. Сенгер встановив амінокислотну послідовність інсуліну. :Цей білок складається з двох поліпептидних ланцюгів, з'єднаних двома дисульфідними зшивками. Один з ланцюгів містить всього 21 амінокислотний залишок, а інший - 30 залишків. На розшифрування будівлі цього порівняно простого білка Сенгер витратив близько 10 років. У 1958 р. за це видатне дослідження йому було присуджено Нобелівську премію. Після створення Ст. Стейном і С. Муром (1957) автоматичного аналізатора амінокислот, ідентифікація продуктів часткового гідролізу білків значно прискорилася. У 1960 р. Стейн і Мур вже повідомили про це. що їм вдалося визначити послідовність рибонуклеази, пептидний ланцюжок якого представлений 124 амінокислотними залишками. У тому ж році в лабораторії Г. Шрамма у Тюбінгені (ФРН) Ф. Андерер та інші визначили амінокислотну послідовність у білку ВТМ. Потім амінокислотна послідовність була визначена в міоглобіні (А. Едмунсон) та α- і β-ланцюгах гемоглобіну людини (Г. Браунітцер, Е. Шредер та ін), лізоцимі з білка курячого яйця (Ж. Жолле, Д. Кейфілд). У 1963 р. Ф. Шорм та Б. Кейл (ЧССР) встановили послідовність амінокислот у молекулі хімотрипсиногену. У тому ж році було визначено амінокислотну послідовність трипсиногену (Ф. Шорм, Д. Уолш). У 1965 р. К. Такахаші встановив первинну структуру рибонуклеази T1. Потім послідовність амінокислот було визначено ще в кількох білків.

Як відомо, остаточним доказом правильності визначення тієї чи іншої структури є її синтез. У 1969 р. Р. Меріфілд (США) вперше здійснив хімічний синтез панкреатичної рибонуклеази. За допомогою розробленого ним методу синтезу на твердофазовому носії Меріфілд приєднував до ланцюжка одну амінокислоту за іншою відповідно до тієї послідовності, яка була описана Стейном і Муром. В результаті він отримав білок, який за своїми якостями був ідентичний панкреатичній рибонуклеазі А. За розкриття будови рибонуклеази В. Стейну, С. Муру та К. Анфінсену було в 1972 р. присуджено Нобелівську премію. Цей синтез природного білка відкриває грандіозні перспективи, вказуючи на можливість створення будь-яких білків відповідно до запланованої послідовності.

З рентгеноструктурних досліджень У. Астбері (1933) випливало, що пептидні ланцюги білкових молекул скручені чи укладені якимось строго певним чином. Починаючи з цього часу, багато авторів висловлювали різні гіпотези про способи укладання білкових ланцюгів, але до 1951 всі моделі залишалися умоглядними побудовами, що не відповідали експериментальним даним. У 1951 р. Л. Полінг та Р. Корі опублікували серію блискучих робіт, в яких остаточно було сформульовано теорію вторинної структури білків - теорію α-спіралі. Поряд з цим стало також відомо, що білки мають ще третинну структуру: α-спіраль пептидного ланцюга може бути певним чином складена, утворюючи досить компактну структуру.

У 1957 р. Дж. Кендрю та його співробітники вперше запропонували тривимірну модель структури міоглобіну. Ця модель потім уточнювалася протягом декількох років, поки в 1961 не з'явилася підсумкова робота з характеристикою просторової структури цього білка. У 1959 р. М. Перутц та співробітники встановили тривимірну структуру гемоглобіну. На цю роботу дослідники витратили понад 20 років (перші рентгенограми гемоглобіну були отримані Перутцем 1937 р.). Оскільки молекула гемоглобіну складається з чотирьох субодиниць, то, розшифрувавши його організацію, Перутц цим вперше описав четвертинну структуру білка. За роботи з визначення тривимірної структури білків Кендрю та Перутцу у 1962 р. було присуджено Нобелівську премію.

Створення Перуком просторової моделі структури гемоглобіну дозволило. наблизитись до розуміння механізму функціонування цього білка, який, як відомо, здійснює перенесення кисню у тварин клітинах. Ще 1937 р. Ф. Гауровиц дійшов висновку у тому, що взаємодія гемоглобіну з киснем, повітря має супроводжуватися зміною структури білка. У 60-х роках Перутц та його співробітники виявили помітне зміщення ланцюгів гемоглобіну після його окислення, що викликалося зрушенням атомів заліза внаслідок зв'язування з киснем. На цій основі сформувалися уявлення про "дихання" білкових макромолекул.

У 1960 р. Д. Філліпс та його співробітники розпочали рентгеноструктурні дослідження молекули лізоциму. До 1967 р. їм більш-менш точно вдалося встановити деталі організації цього білка та локалізацію окремих атомів у його молекулі. Крім цього, Філіпс з'ясував характер приєднання лізоциму до субстрату (тріацетилглюкозаміну). Це дозволило відтворити механізм роботи цього ферменту. Таким чином, знання первинної структури та макромолекулярної організації дало можливість не тільки встановити природу активних центрів багатьох ферментів, а й повністю розкрити механізм цих макромолекул.

Використання методів електронної мікроскопії допомогло розкрити принципи макромолекулярної організації таких складних білкових утворень, як нитки колагену, фібриногену, скорочувальних фібрил м'язів та ін. Наприкінці 50-х років було запропоновано моделі м'язового скорочувального апарату. Виняткове значення розуміння механізму м'язового скорочення мало відкриття У. А. Енгельгардтом і М. М. Любимової (1939) АТФ-азной активності міозину. Це означало, що в основі акта м'язового скорочення лежить зміна фізико-хімічних властивостей та макромолекулярної організації скорочувального білка під впливом аденозинтрифосфорної кислоти (див. розділ 11).

Для розуміння принципів збирання біологічних структур істотне значення мали вірусологічні дослідження (див. Розділ 25).

Невирішені проблеми

Основних успіхів у сучасній молекулярної біології досягнуто переважно у результаті вивчення нуклеїнових кислот. Проте навіть у цій галузі ще далеко не всі проблеми вирішені. Великих зусиль вимагатиме, зокрема, розшифрування всієї нуклеотидної послідовності геному. Ця проблема у свою чергу нерозривно пов'язана з проблемою гетерогенності ДНК і вимагає розробки нових досконалих методів фракціонування та виділення індивідуальних молекул із сумарного генетичного матеріалу клітини.

До цих пір зусилля в основному були зосереджені на окремому вивченні білків та нуклеїнових кислот. У клітині ці біополімери нерозривно пов'язані один з одним і функціонують головним чином у формі нуклеопротеїдів. Тому зараз з особливою гостротою виявилася необхідність вивчення взаємодії білків та нуклеїнових кислот. На перший план висувається проблема впізнавання білками певних ділянок нуклеїнових кислот. Вже намітилися кроки до вивчення такої взаємодії цих біополімерів, без якого немислимо повне розуміння структури та функцій хромосом, рибосом та інших структур. Без цього неможливо також усвідомити регуляцію активності генів та остаточно розшифрувати принципи роботи білоксинтезуючих механізмів. Після робіт Жакоба та Моно з'явилися деякі нові дані про регуляторне значення мембран у синтезі ядерного матеріалу. Це ставить завдання глибшого дослідження ролі мембран у регуляції реплікації ДНК. Загалом проблема регуляції активності генів та клітинної активності взагалі стала однією з найважливіших проблем сучасної молекулярної біології.

Сучасний стан біофізики

У тісному зв'язку з проблемами молекулярної біології йшло розвиток біофізики. Інтерес до цієї галузі біології стимулювався, з одного боку, необхідністю всебічного вивчення впливу на організм різноманітних випромінювань, з іншого - потребою дослідження фізичних і фізико-хімічних основ життєвих явищ, що протікають на молекулярному рівні.

Отримання точних відомостей про молекулярні структури і в них процесах стало можливим в результаті застосування нових тонких фізико-хімічних методів. На основі досягнень електрохімії вдалося вдосконалити метод вимірювання біоелектричних потенціалів, застосувавши іонно-виборчі електроди (Г. Ейзенман, Б. П. Нікольський, Кхурі, 50 – 60-і роки). Дедалі ширше входить у практику інфрачервона спектроскопія (з використанням лазерних пристроїв), що дозволяє досліджувати конформаційні зміни білків (І. Плотніков, 1940). Цінні відомості дає також метод електронного парамагнітного резонансу (Е. К. Завойський, 1944) та біохемолюмінесцентний метод (Б. Н. Тарусов та ін., 1960), які дозволяють, зокрема, судити про транспорт електронів при окислювальних процесах.

До 50-х років біофізика завойовує міцне становище. Виникає потреба у підготовці кваліфікованих фахівців. Якщо у 1911 р. в Європі тільки в університеті м. Печ, в Угорщині, була кафедра біофізики, то до 1973 р. такі кафедри існують майже у всіх великих університетах.

У 1960 р. було організовано Міжнародне товариство біофізиків. Торішнього серпня 1961 р. відбувся перший Міжнародний біофізичний конгрес у Стокгольмі. Другий конгрес було проведено 1965 р. у Парижі, третій - 1969 р. у Бостоні, четвертий - 1972 р. у Москві.

У біофізиці зберігається чітке розмежування між двома різними за змістом напрямами – молекулярною біофізикою та клітинною біофізикою. Це розмежування набуває й організаційне вираження: створюються окремі кафедри цих двох напрямів біофізики. У Московському університеті перша кафедра біофізики була створена в 1953 р. на біолого-ґрунтовому факультеті, дещо пізніше виникла кафедра біофізики на фізичному факультеті. За таким же принципом організовувалися кафедри у багатьох інших університетах.

Молекулярна біофізика

В останні роки все більше зміцнювався зв'язок молекулярної біофізики з молекулярною біологією, і зараз іноді буває важко визначити, де проходить межа поділу між ними. У генеральному наступі на проблему спадкової інформації така кооперація біофізики з молекулярною біологією неминуча.

Головним напрямком у дослідницької роботиє вивчення фізики нуклеїнових кислот – ДНК та РНК. Застосування зазначених вище методів і насамперед рентгеноструктурного аналізу сприяло розшифровці молекулярної структури нуклеїнових кислот. В даний час ведуться інтенсивні дослідження з вивчення поведінки цих кислот у розчинах. Особливу увагуприділяється при цьому конформаційним переходам "спіраль-клубок", що вивчаються щодо змін в'язкості, оптичних та електричних показників. У зв'язку з вивченням механізмів мутагенезу розвиваються дослідження щодо вивчення дії іонізуючої радіації на поведінку нуклеїнових кислот у розчинах, а також дії радіації на нуклеїнові кислоти вірусів та фагів. Всебічного аналізу піддавався вплив ультрафіолетового випромінюваннядеякі спектральні ділянки якого, як відомо, добре поглинаються нуклеїновими кислотами. Велику питому вагу у таких дослідженнях займає виявлення активних радикалів нуклеїнових кислот і білків методом електронного парамагнитного резонансу. Із застосуванням цього пов'язано виникнення цілого самостійного напрями.

Проблема кодування інформації ДНК та РНК та її передачі при синтезі білка давно цікавила молекулярну біофізику, і фізики неодноразово висловлювали з цього приводу ті чи інші міркування (Е. Шредінгер, Г. Гамов). Розшифрування генетичного коду викликало численні теоретичні та експериментальні дослідження щодо структури спіралі ДНК, механізму ковзання та закручування її ниток, вивчення фізичних сил, що беруть участь у цих процесах.

Значну допомогу молекулярна біофізика надає молекулярної біології до вивчення структури білкових молекул з допомогою рентгеноструктурного аналізу, вперше застосованого 1930 р. Дж. Берналом. Саме в результаті використання фізичних методів у поєднанні з біохімічними (ферментативні методи) було розкрито молекулярну конформацію та послідовність розташування амінокислот у ряді білків.

Сучасні електронно-мікроскопічні дослідження, що виявили наявність у клітинах та її органоїдах складних мембранних систем, стимулювали спроби зрозуміти їх молекулярна будова(див. розділи 10 та 11). Вивчається прижиттєво хімічний складмембран та, зокрема, властивості їх ліпідів. Було з'ясовано, що останні здатні до переокислення та неферментативних реакцій ланцюгового окислення (Ю. А. Володимиров та Ф. Ф. Литвин, 1959; Б. Н. Тарусов та ін., 1960; І. І. Іванов, 1967), що призводить до порушення мембранних функцій. Для вивчення складу мембран стали користуватися також методами математичного моделювання (В. Ц. Пресман, 1964 – 1968; М. М. Шемякін, 1967; Ю. А. Овчинніков, 1972).

Клітинна біофізика

Знаменною подією в історії біофізики стало формування в 50-х роках чітких уявлень про термодинаміку біологічних процесів, внаслідок чого остаточно відпали припущення про можливість самостійного утворення енергії в живих клітинах всупереч другому закону термодинаміки. Розуміння дії цього закону в біологічних системах пов'язане із запровадженням бельгійським ученим І. Пригожиним (1945) * у біологічну термодинаміку поняття відкритих систем, що обмінюються із зовнішнім середовищем енергією та матерією. Пригожин показав, що позитивна ентропія утворюється в живих клітинах при робочих процесах відповідно до другого закону термодинаміки. Введені ним рівняння визначили умови, у яких виникає так зване стаціонарне стан (раніше його називали також динамічним рівновагою), у якому кількість вільної енергії (негентропії), що надходить у клітини з їжею, компенсує її витрата, а позитивна ентропія виводиться. Це відкриття підкріпило загальнобіологічну ідею про нерозривний зовнішній зв'язок і внутрішнього середовищаклітин. Воно поклало початок реальному вивченню термодинаміки живих систем, у тому числі методом моделювання (А. Бертон, 1939; А. Г. Пасинський, 1967).

* (Загальну теорію відкритих систем вперше висунув Л. Берталанфі 1932 р.)

Відповідно до основного принципу біотермодинаміки, необхідною умовоюіснування життя виявляється стаціонарність у розвитку її біохімічних процесів, реалізації якої необхідна координація швидкостей численних реакцій обміну речовин. На основі нової біофізичної термодинаміки виник напрям, що виділяє зовнішні та внутрішні фактори, які забезпечують цю координацію реакцій та роблять її стійкою. За останні два десятиліття виявлено велику роль у підтримці стаціонарного стану системи інгібіторів і особливо антиоксидантів (Б. Н. Тарусов та А. І. Журавльов, 1954, 1958). Встановлено, що надійність стаціонарного розвитку пов'язана з факторами зовнішнього середовища (температурою) та фізико-хімічними властивостями середовища клітин.

Сучасні принципи біотермодинаміки дозволили надати фізико-хімічне тлумачення механізму адаптації. За нашими даними, пристосування до умов довкілля може відбуватися тільки в тому випадку, якщо при їх зміні організм здатний встановити стаціонарність у розвитку біо хімічних реакцій(Б. Н. Тарусов, 1974). Постало питання про розробку нових методів, які б дозволили оцінювати стаціонарний стан прижиттєво і прогнозувати його можливі порушення. Велику користь обіцяє впровадження в біотермодинаміку та дослідження процесів біологічної адаптації кібернетичних принципів саморегулівних систем. Стало ясно, що для вирішення питання про стійкість стаціонарного стану важливий облік так званих факторів, що обурюють, до яких відносяться, зокрема, неферментативні реакції окислення ліпідів. Останнім часом дедалі більше розширюються дослідження процесів переокислення у ліпідних фазах живих клітин та наростання активних радикальних продуктів, що порушують регуляторні функції мембран. Джерелом інформації про ці процеси служить як виявлення активних перекисних радикалів, і перекисних сполук біоліпідів (А. Таппель, 1965; І. І. Іванов, 1965; Є. Б. Бурлакова, 1967 та інші). Для виявлення радикалів використовують біохемолюмінесценцію, що виникає у ліпідах живих клітин при їх рекомбінації.

На основі фізико-хімічних уявлень про стабільність стаціонарного стану виникли біофізичні уявлення про адаптацію рослин до змін умов зовнішнього середовища як порушення інгібуючих антиокислювальних систем (Б. М. Тарусов, Я. Є. Доскоч, Б. М. Кітлаєв, А. М. Агавердієв , 1968 – 1972). Це відкрило можливість оцінювати такі властивості, як морозостійкість та солестійкість, а також робити відповідні прогнози під час селекції сільськогосподарських рослин.

У 50-х роках було відкрито надслабке світіння – біохемолюмінесценція низки біологічних об'єктів у видимій та інфрачервоній частинах спектру (Б. Н. Тарусов, А. І. Журавльов, А. І. Поливода). Це стало можливим у результаті розробки методів реєстрації надслабких світлових потоків за допомогою фотоелектронних помножувачів (Л. А. Кубецький, 1934). Будучи результатом біохімічних реакцій, що протікають у живій клітині, біохемолюмінесценція дозволяє судити про важливі окислювальні процеси в ланцюгах перенесення електронів між ферментами. Відкриття та вивчення біохемолюмінесценції має велике теоретичне та практичне значення. Так, Б. Н. Тарусов та Ю. Б. Кудряшов відзначають велику роль продуктів окислення ненасичених жирних кислот у механізмі виникнення патологічних станів, що розвиваються під дією іонізуючих випромінювань, при канцерогенезі та інших порушеннях нормальних функцій клітини.

У 50-х роках у зв'язку з бурхливим розвитком ядерної фізикиз біофізики виділилася радіобіологія, що досліджує біологічну дію іонізуючих випромінювань. Отримання штучних радіоактивних ізотопів, створення термоядерної зброї, атомних реакторів та розвиток інших форм практичного використанняатомної енергії поставило з усією гостротою проблему захисту організмів від шкідливої ​​дії іонізуючої радіації, розробки теоретичних засадпрофілактики та лікування променевої хвороби. Для цього необхідно було насамперед з'ясувати, які компоненти клітини та ланки обміну речовин найбільш уразливі.

Об'єктом вивчення біофізики та радіобіології стало з'ясування природи первинних хімічних реакцій, що виникають у живих субстратах під впливом енергії випромінювань. Тут було важливо зрозуміти механізми цього явища, а й зуміти впливати на процес розміни фізичної енергії на хімічну, зменшити його коефіцієнт " корисного " дії. Роботам у цьому напрямі започаткували дослідження школи Н. Н. Семенова (1933) в СРСР і Д. Хіншельвуда (1935) в Англії.

Велике місце у радіобіологічних дослідженнях зайняло вивчення ступеня радіаційної опірності різних організмів. Було встановлено, що підвищена радіорезистентність (наприклад, гризунів пустель) обумовлена ​​високою антиокислювальною активністю ліпідів клітинних мембран (М. Чанг та ін., 1964; Н. К. Огризов та ін., 1969). Виявилося, що у формуванні антиоксидативних властивостей цих систем велику роль відіграють токофероли, вітамін К та тіосполуки (І. І. Іванов та ін., 1972). В останні роки велику увагу привертають до себе також дослідження механізмів мутагенезу. З цією метою вивчається дія іонізуючих випромінювань на поведінку нуклеїнових кислот та білків in vitro, а також у вірусах та фагах (А. Густафсон, 1945 – 1950).

Боротьба за подальше підвищення ефективності хімічного захисту, пошук більш ефективних інгібіторів та принципів інгібування залишаються у цьому напрямі основними завданнями біофізики.

Просунулося вперед дослідження збуджених станів біополімерів, що визначають їхню високу хімічну активність. Найбільш успішно йшло вивчення збуджених станів, що виникають на первинній стадії фотобіологічних процесів – фотосинтезу та зору.

Так, зроблено солідний внесок у розуміння первинної активації молекул пігментних систем рослин. Встановлено велике значення перекидання (міграції) енергії збуджених станів без втрат активованих пігментів на інші субстрати. Велику роль розвитку цих уявлень зіграли теоретичні роботи А. М. Тереніна (1947 і пізніше). А. А. Красновський (1949) відкрив і досліджував реакцію оборотного фотохімічного відновлення хлорофілу та його аналогів. Нині складається загальне переконання, що найближчим часом можна буде відтворити фотосинтез у штучних умовах (див. також розділ 5).

Біофізики продовжують працювати над розкриттям природи м'язового скорочення та механізмів нервового збудження та проведення (див. розділ 11). Актуального значення набули також дослідження механізмів переходу від збудженого стану до норми. Збуджений стан розглядають тепер як результат автокаталітичної реакції, а гальмування - як наслідок різкої мобілізації інгібіторної антиокислювальної активності в результаті молекулярних перегрупувань в таких сполуках, як токоферол (І. І. Іванов, О. Р. Кольс, 1966; О. Р. Кольс, 1970).

Найважливішою загальною проблемою біофізики залишається пізнання якісних фізико-хімічних особливостей живої матерії. Такі властивості, як здатність живих біополімерів вибірково пов'язувати калій або поляризувати електричний струм, не вдається зберегти навіть при їх обережному витягуванні з організму. Тому клітинна біофізика продовжує інтенсивно розробляти критерії та методи для прижиттєвого дослідження живої матерії.

Незважаючи на молодість молекулярної біології, успіхи, досягнуті нею в цій галузі, справді приголомшливі. порівняно короткий строквстановлено природу гена та основні принципи його організації, відтворення та функціонування. Понад те, здійснено як розмноження генів in vitro, а й уперше завершено повний синтез самого гена. Повністю розшифровано генетичний коді вирішено найважливішу біологічну проблему специфічності біосинтезу білка. Виявлено та досліджено головні шляхи та механізми утворення білка в клітині. Повністю визначено первинну структуру багатьох транспортних РНК - специфічних молекул-адапторів, що здійснюють переклад мови нуклеїнових матриць на мову амінокислотної послідовності білка, що синтезується. До кінця розшифровано амінокислотну послідовність багатьох білків і встановлено просторову структуру деяких з них. Це дозволило з'ясовувати принцип і деталі функціонування молекул ферментів. Здійснено хімічний синтез одного з ферментів – рибонуклеази. Встановлено основні принципи організації різних субклітинних частинок, багатьох вірусів та фагів та розгадано основні шляхи їх біогенезу у клітині. Розкрито підходи до розуміння шляхів регуляції активності генів та з'ясування регуляторних механізмів життєдіяльності. Вже простий перелік цих відкриттів свідчить, що друга половина XX в. ознаменувалася величезним прогресом біології, який зобов'язаний насамперед поглибленому вивченню структури та функцій біологічно найважливіших макромолекул – нуклеїнових кислот та білків.

Досягнення молекулярної біології вже сьогодні використовуються на практиці та приносять відчутні плоди у медицині, сільському господарстві та деяких галузях промисловості. Безперечно, що віддача цієї науки зростатиме з кожним днем. Однак головним підсумком все ж таки слід вважати, що під впливом успіхів молекулярної біології зміцнилася впевненість у існуванні необмежених можливостей на шляху розкриття найпотаємніших таємниць життя.

У майбутньому, мабуть, будуть відкриті нові шляхи дослідження біологічної форми руху матерії. молекулярного рівнябіологія перейде на атомарний рівень. Однак зараз не знайдеться, мабуть, жодного дослідника, який міг би реально передбачити розвиток молекулярної біології навіть на найближчі 20 років.