Фракційне центрифугування принцип. Центрифугування. Визначення молекулярних ваг

Крім фільтрування, поділ суміші рідкого і твердого речовин можливо також шляхом центрифугування, т. Е. Поділу речовин в приладах, званих центрифугами.

Застосування центрифуги засноване на використанні відцентрової сили. При швидкому обертанні (центрифугировании) зважені в рідині тверді частинки (з більшою "щільністю, ніж щільність рідини) під дейт наслідком розвивається при обертанні відцентрової сили відкидаються від центру і таким шляхом відокремлюються від рідини.

Мал. 407. Апарат Тіссена для мікроаналітичних робіт

Мал. 408. Ручна центрифуга

Центрифуги бувають: відкриті і закриті, з ручним і механічним приводом. Основною частиною відкритої ручної центрифуги (рис. 408) є вертикально поставлена \u200b\u200bобертається вісь, перпендикулярно якої на верхньому кінці її прикріплена планка з рухомо укріпленими двома (або чотирма) металевими, гільзами. У ці гільзи вставляють спеціальні сужен-, ні донизу пробірки (рис. 409) з рідиною, з якої потрібно видалити зважені частинки,

На дно гільзи кладуть шматочок вати, «щоб уникнути прямого зіткнення скла з металом. Коли пробірки вставлені в гільзи, центрифугу приводять в рух і через деякий час (залежне від в'язкості рідини, розмірів зважених часток і різниці щільності) відбувається відділення зважених твердих частинок від рідини, після чого центрифугу зупиняють. На дні пробірки збирається щільний осад твердої речовини, над яким знаходиться чиста рідина.

З акритие центрифуги (Рис. 410) в залежності від величини містять різну кількість гільз, від 2 до 12 і більше, розташованих симетрично на однаковій відстані одна від одної і від осі центрифуги.

Механічні закриті центрифуги (Рис. 410, б) більш зручні, ніж ручні (рис. 410, а). Вони дають зазвичай 2000- 3000 об / хв, дозволяють досягти більш досконалого поділу рідини і твердої речовини.

Пробірки для центрифуг після наповнення рідиною повинні мати однакову масу. Там, де центрифугою доводиться користуватися часто, рекомендується мати спеціальні ваги, пристосовані для зважування (вірніше, тарування) пробірок. У зазначених вагах чашки підвішують до коромисла за допомогою стрижнів, прикріплених до центру чашок. На цих стрижнях є кільця, в які вставляють пробірки.

Зміцнивши пробірки, спершу наливають рідину, що підлягає центрифугированию, в одну пробірку (за допомогою, наприклад, піпетки), а потім у другу, домагаючись врівноваження чашок.

Ніколи не слід наливати в пробірки занадто багато рідини; пробірки наповнюють так, щоб відстань від краю до рівня рідини було не менше 10 мм.

Коли потрібно врівноважити багато пробірок, доцільно застосовувати наступний прийом. Зрівноваживши першу пару пробірок, одну з них виймають і поміщають в гніздо центрифуги, а іншу залишають на вагах; ця остання пробірка буде служити еталоном для інших в місце, що звільнилося на вагах місце вставляють іншу пробірку, врівноважують з еталоном і прибирають. Доцільно також попередньо наповнити пробірки (взявши кількість рідини трохи менше, потрібного) і вже при врівноважені додавати необхідну кількість рідини. Такий прийом прискорює роботу.

Мал. 409. Пробірки для центрифуг.

Врівноважені пробірки вставляють в гнізда центрифуги.

Центрифугу слід пускати не відразу на повний хід, а поступово. Це відноситься як до ручних, так і до ме * ханических центрифуг.

Мал. 410. Закриті центрифуги: а - з ручним приводом; б - з електромотором.

Механічні центрифуги для регулювання ско - рости мають відповідні пристосування. Так, електричні центрифуги забезпечені реостатами для поступового включення на повне число обертів. У центрифуг, що приводяться в рух від водяної турбіни, поступовість наростання швидкості руху досягається регулюванням струменя води. Чим обережніше було проведено включення, тим надійніше працює центрифуга.

За центрифугою слід постійно спостерігати; неприпустимо забруднення її, особливо рухомих частин. Металеві гільзи повинні легко і вільно повертатися. Шестерні, що призводять в обертання центрифугу, повинні мати легкий перебіг; їх не можна змащувати такими мастилами, які можуть загуснути. Ось центрифуги також повинна бути в порядку і завжди чистою.

При необережному поводженні з центрифугами, особливо ручними, можна зігнути вісь і цим вивесті.центріфугу з ладу.

Після виключення центрифузі дають зупинитися Самор і тільки після цього виймають пробірки.

Останнім часом починають набувати все більшого поширення так звані суперцентріфугі, що дають до 40 000 об / хв (рис. 411).

Мал. 411 суперцентріфуга

Такі центрифуги особливо зручні для центрифугування всякого роду в'язких розчинів, наприклад лаків, тонких дисперсій, а також емульсій.

Рідина, що підлягає Суперціни-тріфугірованію, надходить в патрубок1, розташований в Нижній частині апарату. Потім рідину виливається в робочий циліндр 2, що обертається зі швидкістю до 40 ТОВ об / хв, в якому відбувається відділення бйлее важких частинок, зважених в рідини. Рідина поступово піднімається по циліндру 2 вгору до роздільник 5, і якщо руйнують емульсію, то легша рідина витікає по стоку 8, а більш важка - по стоку 4. При відділенні твердих частинок з щільністю більше одиниці рідина витікає по стоку 3. На внутрішній стінці робочого циліндра откладикается відокремлюваний твердий осад. Суперцентріфуга. Час від часу суперцентріфугу зупиняють, витягають робочий циліндр 2, очищають його від осддка і, знову поставивши на місце, продовжують роботу. Весь процес очищення робочого циліндра, від моменту зупинки до моменту нового пуску суперцентріфугі, займає не більше 15 хв. Якщо доводиться очищати порівняно великі кількості рідини, то користуються тремя8 суперцентріфугамі: одна - працює, Іншу - очищають, третя - в резерві,

Курсова робота

центрифугування

1. Принцип методу

Поділ речовин за допомогою центрифугування засноване на різному поведінці частинок у відцентровому полі. Суспензію частинок, вміщену в пробірку, завантажують в ротор, встановлений на валу приводу центрифуги.

У відцентровому полі частинки, що мають різну щільність, форму або розміри, осідають з різною швидкістю. Швидкість седиментації залежить від відцентрового прискорення, прямо пропорційного кутовий швидкості ротора і відстані між часткою і віссю обертання:

а відцентрове прискорення тоді дорівнюватиме)

Оскільки один оборот ротора становить 2п радіан, кутову швидкість ротора в оборотах на хвилину можна записати так:

Відцентрове прискорення зазвичай виражається в одиницях gі називається відносне відцентрове прискорення, т. Е.

При перерахуванні умов поділу частинок вказують швидкість обертання і радіус ротора, а також час центрифугування. Відцентрове прискорення зазвичай висловлюють в одиницях g, розрахованих з середнього радіусу обертання стовпчика рідини в центрифужной пробірці. На підставі рівняння Доулом і Котціас була складена номограма, що виражає залежність ОЦУ від швидкості обертання ротора і радіуса р

Швидкість седиментації сферичних частинок залежить не тільки від відцентрового прискорення, але і від щільності і радіусу самих частинок і від в'язкості середовища суспендування. Час, необхідний для осадження сферичної частинки в рідкому середовищі від меніска рідини до дна центрифужной пробірки, обернено пропорційно швидкості седиментації і визначається таким рівнянням:

де t- час седиментації в секундах, rj - в'язкість середовища, ГЧ - радіус частинки, рч - щільність частки, р - щільність середовища, гм - відстань від осі обертання до меніска рідини, гд - відстань від осі обертання до дна пробірки.

Як випливає з рівняння, при заданій швидкості обертання ротора час, необхідний для осадження гомогенних сферичних частинок, обернено пропорційно квадрату їх радіусів і різниці щільності частинок і середовища і прямо пропорційно в'язкості середовища. Тому суміш гетерогенних, приблизно сферичних частинок, що розрізняються по щільності і розмірів, можна розділити або за рахунок різного часу осадження їх на дно пробірки при даному прискоренні, або за рахунок розподілу седіментірующіх частинок вздовж пробірки, що встановлюється через певний проміжок часу. При поділі речовин необхідно враховувати і такі важливі фактори, як щільність і в'язкість середовища. Описаними методами можна розділяти клітинні органели з гомогенатов тканин. Основні компоненти клітини осідають в наступній послідовності: спочатку цілі клітини і їх фрагменти, потім ядра, хлоропласти, мітохондрії, лізосоми, мікросоми і, нарешті, рибосоми. Осадження несферичних часток не підпорядковується рівнянню, тому частинки однакової маси, але різної форми осідають при різних швидкостях. Ця особливість використовується при дослідженні за допомогою ультрацентрифугирования конформації макромолекул.

Препаративне центрифугування полягає у виділенні біологічного матеріалу для подальших біохімічних досліджень. При цьому можна брати великі кількості вихідного біологічного матеріалу, наприклад посіви мікробних клітин з періодичних або безперервних культур, а також посіви рослинних і тваринних клітин з культур тканини і плазми крові. За допомогою препаративної центрифугування виділяють велика кількість клітинних частинок для вивчення їх морфології, структури і біологічної активності. Метод застосовується також для виділення таких біологічних макромолекул, як ДНК і білки з попередньо очищених препаратів.

Аналітичне центрифугування застосовується головним чином для вивчення чистих або майже чистих препаратів макромолекул або частинок, наприклад рибосом. В даному випадку використовується невелика кількість матеріалу, а седиментация досліджуваних частинок безперервно реєструється за допомогою спеціальних оптичних систем. Метод дозволяє отримувати дані про чистоту, молекулярному вазі і структурі матеріалу. У практикумах для студентів препаративное центрифугування застосовується набагато частіше, ніж аналітичне, тому ми зупинимося на ньому більш докладно, хоча в основі обох методів лежать загальні принципи.

2. Препаративне центрифугування

2.1 Диференціальне центрифугування

Цей метод заснований на відмінностях в швидкостях седиментації частинок, що відрізняються один від одного розмірами і щільністю. Розділяється матеріал, наприклад гомогенат тканини, центрифугують при ступінчастому збільшенні відцентрового прискорення, яке вибирається так, щоб на кожному етапі на дно пробірки осаджувалася певна фракція. В кінці кожної стадії осад відокремлюють від надосадової рідини і кілька разів промивають, щоб в кінцевому підсумку отримати чисту осадочную фракцію. На жаль, отримати абсолютно чистий осад практично неможливо; щоб зрозуміти, чому це відбувається, звернемося до розгляду процесу, що відбувається в центрифужной пробірці на початку кожної стадії центрифугування.

Спочатку всі частинки гомогенату розподілені за обсягом центрифужной пробірки рівномірно, тому отримати чисті препарати опадів найважчих частинок за один цикл центрифугування неможливо: перший утворився осад містить в основному найважчі частинки, але, крім цього, також деяку кількість всіх вихідних компонентів. Отримати досить чистий препарат важких частинок можна лише при повторному суспендированием і центрифугировании вихідного осаду. Подальше центрифугування супернатанту при подальшому збільшенні відцентрового прискорення призводить до седиментації частинок середніх розмірів і щільності, а потім і до осадження найдрібніших частинок, що мають найменшу щільність. На рис. 2.3 зображена схема фракціонування гомогенату печінки щура.

Диференціальне центрифугування є, мабуть, найпоширенішим методом виділення клітинних органел з гомогенатов тканин. Найбільш успішно застосовується цей метод для розділення таких клітинних органел, які значно відрізняються один від одного за розмірами і щільності. Але навіть і в цьому випадку одержувані фракції ніколи не бувають абсолютно гомогенними, і для їх подальшого поділу застосовують інші методи, описані нижче. Ці методи, засновані на відмінностях в щільності органел, забезпечують більш ефективне розділення завдяки тому, що центрифугування здійснюють в розчинах з безперервним або ступінчастим градієнтом щільності. Недоліком цих методів є те, що доводиться витрачати час на отримання градієнта щільності розчину.

2.2 Зонально-швидкісне центрифугування

Метод зонально-швидкісного, або, як його ще називають, s-зонального центрифугування, полягає в нашаровуванні досліджуваного зразка на поверхню розчину з безперервним градієнтом щільності. Потім зразок центрифугують до тих пір, поки частки не розподіляться уздовж градієнта у вигляді дискретних зон або смуг. Завдяки створенню градієнта щільності вдається уникнути змішування зон, що виникає в результаті конвекції. Метод зонально-швидкісного центрифугування застосовується для поділу гібридів РНК-ДНК, субодиниць рибосом та інших клітинних компонентів.

2.3 изопикнических центрифугування

Изопикнических центрифугування проводять як в градієнті щільності, так і звичайним шляхом. Якщо центрифугування проводиться не в градієнті щільності, препарат спочатку центрифугують так, щоб осіли частинки, молекулярна вага яких більше, ніж у досліджуваних частинок. Ці важкі частинки відкидають, і зразок суспендують в середовищі, щільність якої така ж, як і у фракції, яку хочуть виділити, а потім центрифугують до тих пір, поки досліджувані частки не осядуть на дно пробірки, а частки меншої щільності не спливуть на поверхню рідини ..

Інший спосіб полягає в нашаровуванні зразка на поверхню розчину з безперервним градієнтом щільності, що охоплює діапазон щільності всіх компонентів суміші. Центрифугування проводять до тих пір, поки плавуча щільність часток не зрівняється з щільністю відповідних зон, т. Е. Поки не відбудеться поділ часток по зонам. Метод отримав назву зонально-изопикнических, або резонального центрифугування, так як основним моментом тут є плавуча щільність, а не розміри або форма частинок. На величину щільності, при якій частинки утворюють изопикнических смуги, впливає природа середовища суспендування; частинки можуть бути проникними для одних сполук, що знаходяться в розчині, і непроникними для інших або ж приєднувати молекули розчину. При використанні зонального ротора мітохондрії, лізосоми, пероксисоми і мікросоми концентруються в смугах з 42%, 47%, 47% і 27% -ної сахарозою, відповідних щільності 1,18, 1,21, 1,21 і 1,10 г-см -3 відповідно. Щільність субклітиннихорганел залежить також і від виборчого поглинання ними певних сполук. Введення щурам що не викликає гемоліз детергента тритона WR-1339 призводить ^ збільшення розмірів і зменшення щільності лізосом печінки; щільність мітохондрій і пероксисом залишається без змін. Незважаючи на те що седиментаційних властивості лізосом при цьому, як правило, не змінюються, їх рівноважна щільність у градієнті сахарози знижується з 1,21 до 1,1, що призводить до відповідного поділу лізосомальної-пероксісомальной фракції. Ця особливість використовується при кількісному поділі лізосом, мітохондрій і пероксисом, заснованому на видаленні з гомогенної середовища всіх частинок з більшою, ніж у мікросом, щільністю і подальшому изопикнических центрифугировании випали в осад важких частинок.

2.4 Рівноважний центрифугування в градієнті щільності

Для створення градієнта щільності використовують солі важких металів, Наприклад рубідію або цезію, а також розчини сахарози. Зразок, наприклад, ДНК, змішують з концентрованим розчином хлористого цезію. І розчинена речовина, і розчинник спочатку розподіляються по всьому об'єму рівномірно. В ході центрифугування встановлюється рівноважний розподіл концентрації, а отже, і щільності CsCl, так як іони цезію мають велику масу. Під дією відцентрового прискорення молекули ДНК перерозподіляються, збираючись у вигляді окремої зони в частині пробірки з відповідною їм щільністю. Метод застосовується головним чином в аналітичному центрифугуванні і був використаний Мезельсоном і Сталем для вивчення механізму реплікації ДНК Е. coli. Рівноважний центрифугування в градієнті щільності є також одним з методів розділення і вивчення ліпопротеїдів плазми крові людини.

2.5Формірованіе і витяг градієнтів

2.5.1 Природа градієнтів

Для створення градієнтів щільності розчинів найчастіше застосовуються розчини сахарози, іноді з фіксованим рН. У деяких випадках хороше поділ виходить при використанні замість звичайної води D2 0. У табл. 2.1 наведені властивості деяких розчинів сахарози.

Вибір градієнта диктується конкретними завданнями фракціонування. Так, наприклад, фікол, що випускається фірмою PharmaciaFineChemicals, може замінювати сахарозу в тих випадках, коли необхідно створити градієнти з великою щільністю і низьким осмотичним тиском. Ще одна перевага фікола полягає в тому, що він не проходить через клітинні мембрани. Для створення градієнтів більшої щільності застосовують солі важких металів, наприклад рубідію і цезію, проте через коррозирующего дії CsCl такі градієнти використовуються тільки в роторах, виготовлених із стійких металів, наприклад титану »

2.5.2 Методика створення ступеневої градієнта щільності

Для створення градієнта щільності в центрифужную пробірку обережно вносять за допомогою піпетки кілька розчинів з послідовно зменшується щільністю. Потім на самий верхній шар, що має найменшу щільність, нашаровуються зразок у вигляді вузької зони, після чого пробірку центрифугують. Отримати плавні лінійні градієнти можна за рахунок згладжування східчастих градієнтів при тривалому стоянні розчину. Процес можна прискорити, обережно перемішуючи вміст пробірки дротом або злегка похитуючи пробірку.

2.5.3 Методика створення плавного градієнта щільності

У більшості випадків для створення плавного градієнта щільності користуються спеціальним пристроєм. Воно складається з двох циліндричних судин чітко визначеного однакового діаметра, сполучених між собою в нижній частині за допомогою скляної трубки з контрольним клапаном, що дозволяє регулювати пропорції, в яких змішується вміст обох судин. Один з них забезпечений мішалкою і має вихідний отвір, через яке розчин стікає в центрифужні пробірки. Більш щільний розчин поміщають в змішувач; другий циліндр заповнюють розчином меншої щільності. Висота стовпчика розчинів в обох циліндрах встановлюється таким чином, щоб гідростатичний тиск в них було однаковим. Більш щільний розчин поступово випускається з змішувача в центрифужні пробірки і одночасно заміщається рівним об'ємом розчину меншої щільності, що надходить в змішувач з другого циліндра через контрольний клапан. Гомогенність розчину в змішувачі забезпечується за рахунок постійного перемішування розчину за допомогою мішалки. У міру зливання розчину в центрифужні пробірки щільність його зменшується і в пробірках створюється лінійний градієнт щільності. Нелінійні градієнти можна створювати за допомогою системи, що складається з двох циліндрів неоднакового діаметра.

Для формування градієнтів щільності різної крутизни користуються системою з двох механічно керованих шприців, які заповнюють розчинами неоднаковою щільності. Різні градієнти можна створювати, змінюючи відносну швидкість руху поршнів.

2.5.4 Витяг градієнтів з центрифужних пробірок

Після завершення центрифугування і поділу часток необхідно витягти утворилися зони. Це роблять декількома способами, найчастіше методом витіснення. Центрифужную пробірку проколюють біля основи і в нижню її частину повільно вводять дуже щільну середу, наприклад 60-70% -ний розчин сахарози. Що знаходиться зверху розчин витісняється, і фракції відбирають за допомогою шприца, піпетки або спеціального пристосування, з'єднаного через трубочку з колектором фракцій. Якщо пробірки виготовлені з целулоїду або нітроцелюлози, фракції витягають, надрізавши пробірку спеціальним лезом. Для цього центрифужную пробірку, закріплену в штативі, надрізають безпосередньо під потрібної зоною і відсмоктують фракцію шприцом або піпеткою. При підходящої конструкції ріжучого пристрою втрата розчину буде мінімальною. Збір фракцій здійснюють також, проколів підставу пробірки тонкої порожнистої голкою. Краплі, що випливають з пробірки через голку, збирають в колектор фракцій для подальшого аналізу.

2.5.5 Препаративні центрифуги і їх застосування

Препаративні центрифуги можна поділити на три основні групи: центрифуги загального призначення, швидкісні центрифуги і препаративні ультрацентрифуги. Центрифуги загального призначення дають максимальну швидкість 6000 об хв-1 і ОЦУ до 6000 g. Вони відрізняються один від одного тільки ємністю і мають ряд змінних роторів: кутових і з підвісними склянками. Однією з особливостей цього виду центрифуг є їх велика ємність - від 4 до 6 дм3, що дозволяє завантажувати їх не тільки Центрифужний пробірками на 10,50 і 100 см3, але і судинами ємністю до 1,25 дм3. У всіх центрифугах цього типу ротори жорстко кріпляться на валу приводу, і центрифужні пробірки разом з їх вмістом повинні бути ретельно врівноважені і відрізнятися за вагою не більше ніж на 0,25 м можна завантажувати в ротор непарне число пробірок, а при неповному завантаженні ротора пробірки слід розміщувати симетрично, одна проти іншої, забезпечуючи таким чином рівномірний розподіл пробірок щодо осі обертання ротора.

Швидкісні центрифуги дають граничну швидкість 25 000 об-хв-1 і ОЦУ до 89000g. Камера ротора забезпечена системою охолодження, що запобігає нагрівання, яке виникає внаслідок тертя при обертанні ротора. Як правило, швидкісні центрифуги мають ємність 1,5 дм3 і забезпечені змінними роторами, як кутовими, так і з підвісними склянками.

Препаративні ультрацентрифуги дають граничну швидкість до 75000 об-хв-1 і максимальне відцентрове прискорення 510 000 g. Вони забезпечені як холодильником, так і вакуумною установкою, щоб запобігти перегріву ротора внаслідок тертя його об повітря. Ротори таких центрифуг виготовляють з високоміцних алюмінієвих або титанових сплавів. В основному застосовують ротори з алюмінієвих сплавів, проте в тих випадках, коли необхідні особливо високі швидкості, користуються роторами з титану. Для зменшення вібрації, яка виникає в результаті порушення рівноваги ротора через нерівномірне наповнення центрифужних пробірок, ультрацентрифуги мають гнучкий вал. Центрифужні пробірки і їх вміст повинні бути ретельно врівноважені з точністю до 0,1 г. Аналогічні вимоги слід дотримуватися і при завантаженні роторів центрифуг загального призначення.

2.6 Конструкція роторів

2.6.1 Кутові ротори і ротори з підвісними склянками

Ротори препаративних центрифуг зазвичай бувають двох типів - кутові і з підвісними склянками. Кутовими вони називаються тому, що поміщаються в них центрифужні пробірки весь час знаходяться під певним кутом до осі обертання. У роторах з підвісними склянками пробірки встановлюються вертикально, а при обертанні під дією виникаючої відцентрової сили переходять в горизонтальне положення; кут нахилу до осі обертання становить 90 °.

У кутових роторах відстань, яку проходить частками до відповідної стінки пробірки, досить невелика, і тому седиментация відбувається порівняно швидко. Після зіткнення зі стінками пробірки частки зісковзують вниз і утворюють на дні осад. При центрифугуванні виникають конвекційні потоки, які в значній мірі ускладнюють поділ частинок з близькими седиментаційним властивостями. Проте ротори подібної конструкції з успіхом застосовуються для поділу часток, швидкості седиментації яких розрізняються досить сильно.

У роторах з підвісними склянками також спостерігаються конвекційні явища, проте виражені вони не так сильно. Конвекція є результатом того, що під дією відцентрового прискорення частинки осідають в напрямку, не строго перпендикулярному осі обертання, і тому, як і в кутових роторах, вдаряються об стінки пробірки і зісковзують на дно.

Конвекційних явищ і ефектів завихрення вдається до певної міри уникнути, використовуючи пробірки секториальной форми в роторах з підвісними склянками і регулюючи швидкість обертання ротора; перерахованих вище, недоліків позбавлений також метод центрифугування в градієнті щільності.

2.6.2 Ротори безперервної дії

Ротори безперервної дії призначені для швидкісного фракціонування відносно невеликих кількостей твердого матеріалу з суспензій великих обсягів, наприклад для виділення клітин з живильних середовищ. В ході центрифугування суспензія частинок додається в ротор безперервно; пропускна здатність ротора залежить від природи осаждаемого препарату і варіюєте межах від 100 см3 до 1 дм3 в 1 хв. Особливість ротора полягає в тому, що він являє собою ізольовану камеру спеціальної конструкції; вміст її не повідомляється із зовнішнім середовищем, а тому не забруднюється і не розпорошується.

2.6.3 Зональні ротори, або ротори Андерсона

Зональні ротори роблять з алюмінієвих або титанових сплавів, які здатні витримувати досить значні відцентрові прискорення. Зазвичай в них є циліндрична порожнина, що закривається кришкою. Всередині порожнини, на осі обертання розташована осьова трубка, на яку надівається насадка з лопатями, які поділяють порожнину ротора на чотири сектори. Лопаті або перегородки мають радіальні канали, за якими з осьової трубки до периферії ротора нагнітається градієнт. Завдяки такій конструкції лопатей конвекція зведена до мінімуму.

Заповнення ротора проводиться при його обертанні зі швидкістю близько 3000 об / хв-1. В ротор нагнітають заздалегідь створений градієнт, починаючи з шару найменшої щільності, який рівномірно розподіляється по периферії ротора і утримується у зовнішній його стінки перпендикулярно осі обертання завдяки відцентровій силі. При подальшому додаванні верств градієнта більшої щільності відбувається безперервне зміщення до центру менш щільних шарів. Після того як в ротор буде нагнітаючи весь градієнт, його заповнюють до повного обсягу розчином, званим «подушкою», щільність якого збігається або трохи перевищує найбільшу щільність преформованих градієнта.

Потім через осьову трубку, нашаровуються досліджуваний зразок, який витісняють з трубки в обсяг ротора за допомогою розчину меншої щільності, при цьому з периферії видаляється такий же обсяг «подушки». Після всіх цих процедур швидкість обертання ротора доводять до робочої і протягом необхідного проміжку часу проводять або зонально-швидкісний, або зонально-изопикнических фракціонування. Витяг фракцій проводять при швидкості обертання ротора 3000 об - хв-1. Вміст ротора витісняють шляхом додавання з периферії «подушки», в першу чергу витісняються менш щільні шари. Завдяки особливій конструкції осьового каналу ротора Андерсона змішування зон при їх витіснення не відбувається. Вихід градієнт пропускають через пристрій, що реєструє, наприклад осередок спектрофотометра, за допомогою якого з поглинання при 280 нм можна визначити вміст білка, або через спеціальний детектор радіоактивності, після чого збирають фракції.

Ємність зональних роторів, використовуваних при середніх швидкостях, варіює від 650 до 1600 см3, що дозволяє отримувати досить велику кількість матеріалу. Зональні ротори застосовуються для видалення білкових домішок з різних препаратів і для виділення і очищення мітохондрій, лізосом, полісом і білків.

2.6.4 Аналіз субклітинних фракцій

Властивості отриманого при фракціонуванні препарату субклітинних частинок можна віднести до властивостей самих частинок тільки в тому випадку, якщо препарат не містить домішок. Отже, завжди необхідно оцінювати чистоту одержуваних препаратів. Ефективність гомогенізації і наявність в препараті домішок можна визначити за допомогою мікроскопічного дослідження. Однак відсутність видимих \u200b\u200bдомішок ще не є достовірним доказом чистоти препарату. Для кількісної оцінки чистоти отриманий препарат піддають хімічному аналізу, Який дозволяє встановити вміст у ньому білків чи ДНК, визначити його ферментативну активність, Якщо можливо, і імунологічні властивості.

Аналіз розподілу ферментів у фракціоніруемих тканинах заснований на двох загальні принципи. Перший з них полягає в тому, що всі частинки даної субклітинному популяції містять однаковий набір ферментів. Другий передбачає, що кожен фермент локалізований в якомусь певному місці всередині клітини. Якби це положення було вірно, то ферменти могли б виступати в ролі маркерів для відповідних органел: наприклад, цито-хромоксідаза і моноамінооксидази служили б ферментами-маркерами мітохондрій, кислі гідролази - маркерами лізосом, каталаза - маркером пероксисом, а глюкозо-6-фосфатаза - маркером мембран мікросом. Виявилося, однак, що деякі ферменти, наприклад малатдегідрогеназа, Р-глюкуронідаза, НАДФ "Н-цитохром-с-редуктаза, локалізовані більш ніж в одній фракції. Тому до вибору ферментів-маркерів субклітинних фракцій в кожному конкретному випадку слід підходити з великою обережністю. більш того, відсутність ферменту-маркера ще не означає відсутності відповідних органел. Цілком імовірно, що при фракціонуванні відбувається втрата ферменту органелами або він відзначено зниження або інактивується; тому для кожної фракції зазвичай визначають не менше двох ферментів-маркерів.

фракція	Обсяг, см "	Загальна розведення	Екснюк-ція, 660 нм	Одиниці активності ферменту	Вихід активності у фракції,%
121	1:35	0,45	515
30	1:21,7	0,195	35,2	6,99
21,5	1:105	0,3	186,3	37
16,5	1:105	0,34	162	32,17
21	1:27,7	0,41	51,5	10,23
287	1:21,7	0,04	68,5	13,61
503,5	100

2.7 Фракціонування методом диференціального центрифугування

2.7.1 Оформлення результатів

Результати, отримані при фракціонуванні тканин, найзручніше оформляти у вигляді графіків. Так, при дослідженні розподілу ферментів в тканинах дані найкраще представляти в вигляді гістограм, що дають можливість візуально оцінити результати проведених експериментів.

Ферментативну активність вміст білка в пробі визначають як в вихідному гомогенате, так і в кожної виділеної субклітинному фракції окремо. Сумарна ферментативна активність і вміст білка у фракціях не повинні сильно відрізнятися від відповідних значень в вихідному гомогенате.

Потім проводять розрахунок ферментативної активності та вмісту білка в кожній фракції в% від загального виходу, на підставі чого складають гистограмму. По осі абсцис послідовно відкладають відносне колічество_ білка в кожній фракції в порядку їх виділення, а по осі ординат - відносну питому активність кожної фракції. Таким чином, за площею стовпчиків визначають ферментативну активність кожної фракції.

2.7.2 Аналітичне ультрацентрифугирование

На відміну від препаратівного центрифугування, метою якого є поділ речовин і їх очищення, аналітичне ультрацентрифугирование застосовується в основному для вивчення седиментаційних властивостей біологічних макромолекул та інших структур. Тому в аналітичному центрифугуванні застосовують ротори і реєструючі системи особливої \u200b\u200bконструкції: вони дозволяють безперервно спостерігати за седиментацією матеріалу в відцентровому полі.

Аналітичні ультрацентрифуги можуть розвивати швидкість до 70 000 об-хв-1, створюючи при цьому відцентрове прискорення до 500 000 g. Ротор у них, як правило, має форму еліпсоїда і з'єднаний за допомогою струни з мотором, що дозволяє варіювати швидкість обертання ротора. Обертається ротор у вакуумній камері, забезпеченою холодильним пристроєм, і має два відділення, аналітичну і балансуючу, які встановлюються в центрифузі суворо вертикально, паралельно осі обертання. Балансировочная осередок служить для врівноваження аналітичної і являє собою металевий блок з прецизійною системою. У ній є також два індексних отвори, що знаходяться на строго певній відстані від осі обертання, за допомогою яких визначають відповідні відстані в аналітичній осередку. Аналітична осередок, ємність якої, як правило, дорівнює 1 см3, має секторіальних форму. При правильній установці в роторі вона, незважаючи на те що стоїть вертикально, працює за тим же принципом, що і ротор з підвісними склянками, створюючи майже ідеальні умови седиментації. На торцях аналітичної осередку є віконця з кварцовими стеклами. Аналітичні ультрацентрифуги забезпечені оптичними системами, що дозволяють спостерігати за седиментацією частинок протягом всього періоду центрифугування. Через задані проміжки часу седіментірующій матеріал можна фотографувати. При фракціонуванні білків і ДНК за седиментацією спостерігають з поглинання в ультрафіолеті, а в тих випадках, коли досліджувані розчини мають різні коефіцієнти заломлення - за допомогою шлірен-системи або інтерференційної системи Релея. Два останніх методу засновані на тому, що при проходженні світла через прозорий розчин, що складається з зон з різною щільністю, на кордоні зон відбувається заломлення світла. При седиментації між зонами з важкими і легкими частинками утворюється межа, яка діє як переломлюються лінза; при цьому на фотопластинці, що використовується в якості детектора, з'являється пік. В ході седиментації відбувається переміщення кордону, а отже, і піку, за швидкістю пересування якого можна судити про швидкість седиментації матеріалу. Інтерферометричні системи відрізняються більшою чутливістю, ніж шлірен-системи. Аналітичні осередки бувають односекторние, які застосовуються найбільш часто, і двухсекторной, які використовуються для порівняльного вивчення розчинника і розчиненої речовини.

У біології аналітичне ультрацентрифугирование застосовується для визначення молекулярних ваг макромолекул, перевірки чистоти одержуваних зразків, а також для дослідження конформаційних змін в макромолекулах.

2.8 Застосування аналітичного ультрацентрифугирования

2.8.1 Визначення молекулярних ваг

Існує три основні методи визначення молекулярних ваг за допомогою аналітичного ультрацентрифугирования: визначення швидкості седиментації, метод седіментаціоіного рівноваги і метод наближення до седиментаційної рівноваги.

Визначення молекулярної ваги за швидкістю седиментації - це найбільш поширений метод. Центрифугування проводять при великих швидкостях, так що частинки, спочатку рівномірно розподілені по всьому об'єму, починають впорядкування переміщатися по радіусу від центру обертання. Між областю розчинника, вже вільної від часток, і тією його частиною, яка їх містить, утворюється чітка межа розділу. Ця межа при центрифугуванні переміщається, що дає можливість визначати швидкість седиментації частинок за допомогою одного з вищезазначених методів, реєструючи це переміщення на фотопластинці.

Швидкість седиментації визначається наступним співвідношенням:

де х - відстань від осі обертання в см,

t- час в с,

w - кутова швидкість в радий-с-1,

s- коефіцієнт седиментації «молекули.

Коефіцієнт седиментації - це швидкість, віднесена до одиниці прискорення, його вимірюють в одиницях Сеедберга; 1 одиниця Сведберга дорівнює 10_13 с. Чисельне значення s залежить від молекулярного ваги і форми частинок і є величиною, характерною для даної молекули або надмолекулярної структури. Наприклад, коефіцієнт седиментації лізоциму дорівнює 2,15 S; катав аза має коефіцієнт седиментації 11.35S, субодиниці рибосом бактерій - від 30 до 50S, а субодиниці рибосом еукаріотів - від 40 до 60S.

де М - молекулярна маса молекули, R- газова постійна, Т - абсолютна температура, S - коефіцієнт седиментації молекули, D- коефіцієнт дифузії молекули, v- парціальний питомий об'єм, який можна розглядати як обсяг, яку він обіймав одним грамом розчиненої речовини, р - щільність розчинника.

Метод седіментаціоіного рівноваги. Визначення молекулярних ваг цим методом проводиться при порівняно невеликих швидкостях обертання ротора, близько 7 000-8 000 об-хв-1, щоб молекули з великою молекулярною вагою не осідали на дно. Ультрацентрофугування проводять аж до досягнення частками рівноваги, що встановлюється під дією відцентрових сил, з одного боку, і дифузійних - з іншого, т. Е. До тих пір, поки частки не перестануть переміщатися. Потім по утворився градієнту концентрації розраховують молекулярну масу речовини "згідно з формулою

де R- газова постійна, Т - абсолютна температура, ю - кутова швидкість, р - щільність розчинника, v- парціальний питомий об'єм, сх і с2 - концентрація розчиненої речовини на відстанях рр і г2 від осі обертання.

Недоліком даного методу є те, що для досягнення седіментаціоіного рівноваги необхідно тривалий час - від декількох днів до декількох тижнів при безперервній роботі центрифуги.

Метод наближення до седиментаційної рівноваги билразработан для того, щоб позбутися від недоліків попереднього методу, пов'язаних з великими витратами часу, необхідного для "встановлення рівноваги. За допомогою цього методу можна визначати молекулярні ваги, коли центріфугіруемий розчин знаходиться в стані наближення до рівноваги. Спочатку макромолекули розподіляються по всьому об'єму аналітичної осередку рівномірно, потім у міру центрифугування молекули осідають, і щільність розчину в області меніска поступово зменшується. Зміна щільності ретельно реєструють, а потім шляхом складних розрахунків, що включають велике число змінних, визначають молекулярну масу даного з'єднання за формулами:

де R- газова постійна, Т - абсолютна температура, v - парціальний питомий об'єм, р - щільність розчинника, dcldr- градієнт концентрації макромолекули, гм і гд - відстань до меніска і дна пробірки відповідно, см і сд - концентрація макромолекул у меніска і у дна пробірки відповідно, мм і MR-величина молекулярних ваг, певні за розподілом концентрації речовини у меніска і дна пробірки відповідно.

2.8.2 Оцінка чистоти препаратів

Аналітичне ультрацентрифугирование широко застосовується для оцінки чистоти препаратів ДНК, вірусів і білків. Чистота препаратів безсумнівно дуже важлива в тих випадках, коли потрібно точно визначити молекулярну вагу молекули. У більшості випадків про гомогенності препарату можна судити за характером кордону седиментації, використовуючи метод визначення швидкості седиментації: гомогенний препарат зазвичай дає одну різко обкреслені кордон. Присутні в препараті домішки проявляються у вигляді додаткового піку або плеча; вони ж обумовлюють асиметрію основного піку.

2.8.3 Дослідження конформаційних змін в макромолекулах

Ще одна область застосування аналітичного ультрацентрифугирования - дослідження конформаційних змін макромолекул. Молекула ДНК, наприклад, може бути одно- або двухцепочечной, лінійною або кільцевою. Під дією різних сполук або при підвищених температурах ДНК зазнає ряд оборотних і необоротних конформаційних змін, які можна встановити по зміні швидкості седиментації зразка. Чим компактніше молекула, тим менше її коефіцієнт тертя в розчині і навпаки: чим менше вона компактна, тим більше коефіцієнт тертя і, отже, тим повільніше буде вона седіментіровать. Таким чином, відмінності в швидкості седиментації зразка до і після різних впливів на нього дозволяють виявляти конформаційні зміни, що відбуваються в макромолекулах.

У аллостеріческіх білків, таких, наприклад, як аспартат-транскарбамоілаза, конформаційні зміни виникають в результаті зв'язування їх з субстратом і малими лігандами. Дисоціацію білка на субодиниці можна викликати, обробивши його такими речовинами, як сечовина або парахлормеркурібензоат. Всі ці зміни легко можна простежити за допомогою аналітичного ультрацентрифугирования.

лекція №5

Розділення рідких неоднорідних сумішей ефективно проводиться методом центрифугування, заснованим на використанні відцентрової сили. Апарати, в яких рідкі неоднорідні суміші поділяються під дією відцентрової сили, називаються центрифугами.

Метод центрифугування широко використовують в різних областях техніки; число типів і конструкцій центрифуг дуже велике.

Основною частиною центрифуги є барабан (ротор з суцільними або перфорованими стінками), що обертається з великою швидкістю на вертикальному або горизонтальному валу. Поділ неоднорідних сумішей в центрифугах може проводитися або за принципом відстоювання, або за принципом фільтрації. У першому випадку використовують барабани із суцільними стінками, у другому - з отворами; барабани з отворами покриваються фільтром. Якщо стінки барабана суцільні, то матеріал під дією відцентрової сили розташовується шарами відповідно до питомої ваги, причому безпосередньо під стінами барабана розташовується шар матеріалу з великою питомою вагою. Якщо стінки барабана мають отвори і забезпечені на внутрішній поверхні фільтруючого перегородкою, наприклад фільтрувальної тканиною, то тверді частинки суміші залишаються на фільтрує перегородці, а рідка фаза проходить через пори твердого осаду і фільтрувальної перегородки і видаляється з барабана. Рідка фаза, відокремлювана на центрифузі, називається фугато.

Відцентрова сила; фактор поділу.При обертанні барабана центрифуги і знаходиться в ньому рідини виникає відцентрова сила як сила інерції.

С \u003d m W 2 / r (1)

m-вага обертового тіла (рідини) в кгс;

r-радіус обертання в м

W -Окружні швидкість обертання в м / с;

Окружна швидкість обертання визначається як:

W \u003d ω r \u003d 2 π n r / 60 (2)

пчисло оборотів в хвилину;

ω-кутова швидкість обертання в радіанах

g-прискорення сили тяжіння в м / сек 2, Якщо m \u003d G / g, тоді відцентрова сила С,діюча на тіло, що обертається з масою m і вагою G,дорівнює C \u003d G (2π n r / 60) 2 / rg Або C ≈ G n 2 r / 900 (3)

Рівняння (2,3) показує, що збільшення відцентрової сили легше досягається збільшенням числа оборотів, ніж збільшенням діаметра барабана. Барабани невеликого діаметра, але з великим числом оборотів можуть розвинути велику відцентрову силу, ніж барабани великого діаметра, але при невеликому числі оборотів.

Таким чином, відцентрова сила, що діє на частинку, може бути більше сили тяжіння в стільки разів, у скільки прискорення відцентрової сили більше прискорення вільного падіння. Ставлення цих прискорень називають фактором поділу і позначають Кр:

W 2 / r - прискорення відцентрової сили.

Прийнявши G \u003d 1 н, отримаємо: Кр \u003d n 2 r / 900

Наприклад, для центрифуги з ротором діаметром 1000 мм (r \u003d 0,5 м), що обертається зі швидкістю n \u003d 1200 об / хв, фактор поділу складе 800. поділяють дію центрифуги зростає пропорційно величині Кр.

Значення К для циклонів має порядок сотень. А для центрифуг - близько 3000, таким чином, рушійна сила процесу осадження в циклонах і центрифугах на 2-3 порядки більше, ніж у відстійниках. Завдяки цьому продуктивність циклонів і центрифуг вище продуктивності відстійників, і в них можна ефективно відокремлювати дрібні частинки: В центрифугах розміром близько 1 мкм. У циклонах - близько 10 мкм.

З порівняння рівнянь видно, що фактор поділу К р чисельно дорівнює відцентрової сили, що розвивається при обертанні тіла вагою 1 кг.

Характеристика процесів центрифугування . Як було зазначено вище, центрифугування можна проводити за принципом відстоювання (в суцільних барабанах) або за принципом фільтрації (в дірчастих барабанах). По своїй фізичній суті обидва процеси відрізняються один від одного. Крім того, є окремі різновиди кожного з цих процесів, які визначаються змістом твердої фази і ступенем її дисперсності, а також фізичними властивостями суспензії.

Центрифугування в відстійних барабанах виробляють як для очищення рідин від забруднень, що містяться в невеликих кількостях (освітлення рідин), так і для розділення суспензій, що містять значну кількість твердої фази (відстійне центрифугування).

Центрифугування в відстійних барабанах в загальному випадку складається з двох фізичних процесів: осадження твердої фази (процес проходить за законами гідродинаміки) та ущільнення осаду; до останнього процесу застосовні основні закономірності механіки грунтів (дисперсних середовищ).

До певної межі концентрації твердої фази (рівного орієнтовно 3-4% за обсягом) її осадження в отстойном барабані протікає без утворення поверхні розділу між твердою речовиною і рідиною. При підвищенні концентрації така поверхня утворюється внаслідок укрупнення і осадження знаходяться в рідині твердих частинок.

Процес центрифугування в відстійних барабанах принципово відрізняється від процесу поділу в відстійниках. В останніх швидкість осадження практично можна вважати постійної, так як процес відбувається в полі тяжіння, прискорення якого не залежить від координат падаючої частинки.

Прискорення ж поля відцентрових сил є величиною змінною і залежить при постійній кутовий швидкості від радіуса обертання rчастіци. Крім того, силові лінії відцентрового поля не паралельні один одному і, отже, напрямок дії відцентрових сил буде неоднаково для різних частинок (Які не лежать на одному радіусі обертання).

Тому закономірності процесів відстоювання можна поширювати на процес центрифугування в відстійних барабанах.

Розділяє здатність відстійних центрифуг характеризується індексом продуктивності (сигма) Σ, який є твором площі циліндричної поверхні осадження F в роторі на фактор поділу Кр.

Σ \u003d F Кр (1), Кр \u003d W2 / rg ≈n2 r / 900, звідки Σ / F \u003d Кр (2)

З огляду на, що фактор поділу виражає відношення швидкостей відстоювання частинок ввідстойної центрифузі і відстійнику, відповідно до рівністю (2) величину Σ слід вважати рівною площі відстійника, еквівалентного по продуктивності для даної суспензії розглянутої центрифузі. Індекс продуктивності відображає вплив усіх конструктивних особливостей осадительной центрифуги, що визначають її роздільну здатність.

При визначенні продуктивності відстійних центрифуг періодичної дії необхідно враховувати витрати часу на пуск, гальмування і розвантаження центрифуги Визначення продуктивності фільтрує центрифуги так само складно, як і визначення продуктивності будь-якого фільтра.

Ще більш складним є процес центрифугування в фільтруючих барабанах. Процес протікає в три стадії:

утворення осаду, ущільнення осаду і, нарешті, видалення з пор осаду рідини, що утримується капілярними і молекулярними силами.

Внаслідок цього весь процес відцентрової фільтрації не може бути ототожнений зі звичайною фільтрацією, яка відбувається під дією сил тяжіння. Лише перший його період принципово близький до звичайної фільтрації і відрізняється від неї лише величиною гідравлічного напору рідини, що протікає через шар осаду під дією відцентрових сил. У цей період волога в осаді знаходиться у вільній формі і видаляється з нього найбільш інтенсивно. Другий період аналогічний відповідного періоду при отстойном центрифугировании і, нарешті, третій характеризується проникненням повітря в ущільнений осад, т. Е. Механічної сушінням осаду

Тривалість зазначених вище періодів залежить від фізичних властивостей і концентрації суспензій, а також від характеристики центрифуги.

Складність і різноманіття процесів центрифугування ускладнює розробку теорії процесу (особливо його кінетика) і точних методів розрахунку центрифуг.

продуктивність центрифуг. Зазвичай продуктивність центрифуг висловлюють обсягом суспензії, що надходить в центрифугу в одиницю часу (Л / год),або вагою осаду, що виходить після центрифугування (Кг / год).

Метод центрифугування заснований на різному поведінці частинок у відцентровому полі, створюваному центрифугою. Зразок, що знаходиться в посудині для центрифугування, поміщають в ротор, який приводиться в рух приводом центрифуги. Для поділу суміші частинок необхідно вибрати набір умов, таких як швидкість обертання, час центрифугування та радіус ротора. Сферичний швидкість осадження (седиментації) залежить не тільки від прискорення, але і від радіуса і щільності частинок, а так само від в'язкості середовища, в якій проводиться осадження зразка.

Центрифугування можна розділити на два види: препаративное і аналітичне. Препаративне центрифугування використовується в разі, коли необхідно виділити частину зразка для подальших досліджень. Цей метод застосовується для виділення клітин з суспензії, біологічних макромолекул і т.д.

Аналітичне центрифугування застосовується для вивчення поведінки біологічних макромолекул у відцентровому полі. Даний метод дозволяє отримувати дані про масу, форму і розміри молекул, що знаходяться у відносно невеликих обсягах зразка. У повсякденній практиці роботи в лабораторії найчастіше зустрічається препаративное центрифугування.

Препаративні лабораторні центрифуги, в свою чергу, поділяються на групи за призначенням: препаративні ультрацентрифуги, центрифуги загального призначення і швидкісні центрифуги. Центрифуги загального призначення мають найбільше практичне застосування в медичних лабораторіях, мають максимальну швидкість до 6 тисяч об / хв. Основною особливістю даного виду приладів є їх відносно велика ємність - до 6 літрів, що дозволяє використовувати для центрифугування не тільки центрифужні пробірки об'ємом до 100 мл, а й ємності до 1.25 літра. У всіх центрифугах загального призначення ротори жорстко кріпляться на валу приводу, тому центріфугіруемие ємність повинні бути досить точно врівноважені. Щоб уникнути поломки, не слід завантажувати в ротор непарна кількість пробірок, при неповному завантаженні ємність слід розміщувати один навпроти одного.

Швидкісні центрифуги мають граничну швидкість 25 тис. Об / хв і прискорення до 89 тис g. Камеру, в якій знаходиться ротор і центріфугірумеие зразки, оснащують системою охолодження для запобігання нагрівання, що виникає від тертя при обертанні ротора на великих швидкостях. Зазвичай, такі центрифуги можуть працювати з об'ємом до 1.5 літра і оснащуються кутовими роторами або роторами зі змінними склянками.

Препаративні ультрацентрифуги розганяються до 75000 об / хв і мають максимальне відцентрове прискорення 510 тис g. Їх оснащують холодильної та вакуумної установками, для запобігання перегріву ротора від тертя об повітря. Ротори для цих центрифуг виготовляють з високоміцних титанових або алюмінієвих сплавів. Вал ультрацентрифуг, на відміну від швидкісних і препаративних, робиться гнучким для зменшення вібрації при порушенні рівноваги ротора. Ємності в роторі повинні бути ретельно врівноважені з точністю до однієї десятої грама.

Курсова робота

центрифугування

1. принцип методу

а відцентрове прискорення тоді дорівнюватиме)

Відцентрове прискорення зазвичай виражається в одиницях g і називається відносне відцентрове прискорення, Т. Е.

При перерахуванні умов поділу частинок вказують швидкість обертання і радіус ротора, а також час центрифугування. Відцентрове прискорення зазвичай висловлюють в одиницях g, розрахованих із середнього радіусу обертання стовпчика рідини в центрифужной пробірці. На підставі рівняння Доулом і Котціас була складена номограма, що виражає залежність ОЦУ від швидкості обертання ротора і радіуса р

де t - час седиментації в секундах, rj - в'язкість середовища, г ч - радіус частинки, р ч - щільність частки, р - щільність середовища, г м - відстань від осі обертання до меніска рідини, г д - відстань від осі обертання до дна пробірки.

полягає у виділенні біологічного матеріалу для подальших біохімічних досліджень. При цьому можна брати великі кількості вихідного біологічного матеріалу, наприклад посіви мікробних клітин з періодичних або безперервних культур, а також посіви рослинних і тваринних клітин з культур тканини і плазми крові. За допомогою препаративної центрифугування виділяють велику кількість клітинних частинок для вивчення їх морфології, структури і біологічної активності. Метод застосовується також для виділення таких біологічних макромолекул, як ДНК і білки з попередньо очищених препаратів.

аналітичне центрифугування застосовується головним чином для вивчення чистих або майже чистих препаратів макромолекул або частинок, наприклад рибосом. В даному випадку використовується невелика кількість матеріалу, а седиментация досліджуваних частинок безперервно реєструється за допомогою спеціальних оптичних систем. Метод дозволяє отримувати дані про чистоту, молекулярному вазі і структурі матеріалу. У практикумах для студентів препаративное центрифугування застосовується набагато частіше, ніж аналітичне, тому ми зупинимося на ньому більш докладно, хоча в основі обох методів лежать загальні принципи.

2. Препаративне центрифугування

2.1 Диференціальне центрифугування

2.2 Зонально-швидкісний центрифугування

2.3 изопикнических центрифугування

2.4 Рівноважний центрифугування в градієнті щільності

Для створення градієнта щільності використовують солі важких металів, наприклад рубідію або цезію, а також розчини сахарози. Зразок, наприклад, ДНК, змішують з концентрованим розчином хлористого цезію. І розчинена речовина, і розчинник спочатку розподіляються по всьому об'єму рівномірно. В ході центрифугування встановлюється рівноважний розподіл концентрації, а отже, і щільності CsCl, так як іони цезію мають велику масу. Під дією відцентрового прискорення молекули ДНК перерозподіляються, збираючись у вигляді окремої зони в частині пробірки з відповідною їм щільністю. Метод застосовується головним чином в аналітичному центрифугуванні і був використаний Мезельсоном і Сталем для вивчення механізму реплікації ДНК Е. coli . Рівноважний центрифугування в градієнті щільності є також одним з методів розділення і вивчення ліпопротеїдів плазми крові людини.

2. 5 Формування і витяг градієнтів

2.5.1 Природа градієнтів

Для створення градієнтів щільності розчинів найчастіше застосовуються розчини сахарози, іноді з фіксованим рН. У деяких випадках хороше поділ виходить при використанні замість звичайної води D 2 0. У табл. 2.1 наведені властивості деяких розчинів сахарози.

Вибір градієнта диктується конкретними завданнями фракціонування. Так, наприклад, фікол, що випускається фірмою Pharmacia Fine Chemicals, може замінювати сахарозу в тих випадках, коли необхідно створити градієнти з великою щільністю і низьким осмотичним тиском. Ще одна перевага фікола полягає в тому, що він не проходить через клітинні мембрани. Для створення градієнтів більшої щільності застосовують солі важких металів, наприклад рубідію і цезію, проте через коррозирующего дії CsCl такі градієнти використовуються тільки в роторах, виготовлених із стійких металів, наприклад титану »

2.5.2 Методика створення ступеневої градієнта щільності

2.5.3 Методика створення плавного градієнта щільності

2.5.4 Витяг градієнтів з центрифужних пробірок

2.5.5 Препаративні центрифуги і їх застосування

Препаративні центрифуги можна поділити на три основні групи: центрифуги загального призначення, швидкісні центрифуги і препаративні ультрацентрифуги. Центрифуги загального призначення дають максимальну швидкість 6000 об хв -1 і ОЦУ до 6000 g . Вони відрізняються один від одного тільки ємністю і мають ряд змінних роторів: кутових і з підвісними склянками. Однією з особливостей цього виду центрифуг є їх велика ємність - від 4 до 6 дм 3, що дозволяє завантажувати їх не тільки Центрифужний пробірками на 10,50 і 100 см 3, але і судинами ємністю до 1,25 дм 3. У всіх центрифугах цього типу ротори жорстко кріпляться на валу приводу, і центрифужні пробірки разом з їх вмістом повинні бути ретельно врівноважені і відрізнятися за вагою не більше ніж на 0,25 м можна завантажувати в ротор непарне число пробірок, а при неповному завантаженні ротора пробірки слід розміщувати симетрично, одна проти іншої, забезпечуючи таким чином рівномірний розподіл пробірок щодо осі обертання ротора.

швидкісні центрифуги дають граничну швидкість 25 000 об-хв -1 і ОЦУ до 89000g. Камера ротора забезпечена системою охолодження, що запобігає нагрівання, яке виникає внаслідок тертя при обертанні ротора. Як правило, швидкісні центрифуги мають ємність 1,5 дм 3 і забезпечені змінними роторами, як кутовими, так і з підвісними склянками.

препаративні ультрацентрифуги дають граничну швидкість до 75000 об-хв -1 і максимальне відцентрове прискорення 510 000 g . Вони забезпечені як холодильником, так і вакуумною установкою, щоб запобігти перегріву ротора внаслідок тертя його об повітря. Ротори таких центрифуг виготовляють з високоміцних алюмінієвих або титанових сплавів. В основному застосовують ротори з алюмінієвих сплавів, проте в тих випадках, коли необхідні особливо високі швидкості, користуються роторами з титану. Для зменшення вібрації, яка виникає в результаті порушення рівноваги ротора через нерівномірне наповнення центрифужних пробірок, ультрацентрифуги мають гнучкий вал. Центрифужні пробірки і їх вміст повинні бути ретельно врівноважені з точністю до 0,1 г. Аналогічні вимоги слід дотримуватися і при завантаженні роторів центрифуг загального призначення.

2.6 Конструкція роторів

2.6.1 Кутові ротори і ротори з підвісними склянками

2.6.2 Ротори безперервної дії

Ротори безперервної дії призначені для швидкісного фракціонування відносно невеликих кількостей твердого матеріалу з суспензій великих обсягів, наприклад для виділення клітин з живильних середовищ. В ході центрифугування суспензія частинок додається в ротор безперервно; пропускна здатність ротора залежить від природи осаждаемого препарату і варіюєте межах від 100 см 3 до 1 дм 3 в 1 хв. Особливість ротора полягає в тому, що він являє собою ізольовану камеру спеціальної конструкції; вміст її не повідомляється із зовнішнім середовищем, а тому не забруднюється і не розпорошується.

2.6.3 Зональні ротори, або ротори Андерсона

Заповнення ротора проводиться при його обертанні зі швидкістю близько 3000 об / хв -1. В ротор нагнітають заздалегідь створений градієнт, починаючи з шару найменшої щільності, який рівномірно розподіляється по периферії ротора і утримується у зовнішній його стінки перпендикулярно осі обертання завдяки відцентровій силі . При подальшому додаванні верств градієнта більшої щільності відбувається безперервне зміщення до центру менш щільних шарів. Після того як в ротор буде нагнітаючи весь градієнт, його заповнюють до повного обсягу розчином, званим «подушкою», щільність якого збігається або трохи перевищує найбільшу щільність преформованих градієнта.

Потім через осьову трубку, нашаровуються досліджуваний зразок , який витісняють з трубки в обсяг ротора за допомогою розчину меншої щільності, при цьому з периферії видаляється такий же обсяг «подушки». Після всіх цих процедур швидкість обертання ротора доводять до робочої і протягом необхідного проміжку часу проводять або зонально-швидкісний, або зонально-изопикнических фракціонування . Витяг фракцій проводять при швидкості обертання ротора 3000 об - хв -1. Вміст ротора витісняють шляхом додавання з периферії «подушки», в першу чергу витісняються менш щільні шари . Завдяки особливій конструкції осьового каналу ротора Андерсона змішування зон при їх витіснення не відбувається. Вихід градієнт пропускають через пристрій, що реєструє, наприклад осередок спектрофотометра, за допомогою якого з поглинання при 280 нм можна визначити вміст білка, або через спеціальний детектор радіоактивності, після чого збирають фракції.

Ємність зональних роторів, використовуваних при середніх швидкостях, варіює від 650 до 1600 см 3, що дозволяє отримувати досить велику кількість матеріалу. Зональні ротори застосовуються для видалення білкових домішок з різних препаратів і для виділення і очищення мітохондрій, лізосом, полісом і білків.

2.6.4 Аналіз субклітинних фракцій

Властивості отриманого при фракціонуванні препарату субклітинних частинок можна віднести до властивостей самих частинок тільки в тому випадку, якщо препарат не містить домішок. Отже, завжди необхідно оцінювати чистоту одержуваних препаратів. Ефективність гомогенізації і наявність в препараті домішок можна визначити за допомогою мікроскопічного дослідження. Однак відсутність видимих \u200b\u200bдомішок ще не є достовірним доказом чистоти препарату. Для кількісної оцінки чистоти отриманий препарат піддають хімічному аналізу, який дозволяє встановити вміст у ньому білків чи ДНК, визначити його ферментативну активність, якщо можливо, і імунологічні властивості.

Аналіз розподілу ферментів у фракціоніруемих тканинах заснований на двох загальних принципах. Перший з них полягає в тому, що всі частинки даної субклітинному популяції містять однаковий набір ферментів. Другий передбачає, що кожен фермент локалізований в якомусь певному місці всередині клітини. Якби це положення було вірно, то ферменти могли б виступати в ролі маркерів для відповідних органел: наприклад, цито-хромоксідаза і моноамінооксидази служили б ферментами-маркерами мітохондрій, кислі гідролази - маркерами лізосом, каталаза - маркером пероксисом, а глюкозо-6-фосфатаза - маркером мембран мікросом. Виявилося, однак, що деякі ферменти, наприклад малатдегідрогеназа, Р-глюкуронідаза, НАДФ "Н-цитохром-с-редуктаза, локалізовані більш ніж в одній фракції. Тому до вибору ферментів-маркерів субклітинних фракцій в кожному конкретному випадку слід підходити з великою обережністю. Більш того, відсутність ферменту-маркера ще не означає відсутності відповідних органел. Цілком імовірно, що при фракціонуванні відбувається втрата ферменту органелами або він відзначено зниження або інактивується; тому для кожної фракції зазвичай визначають не менше двох ферментів-маркерів.

фракція	Обсяг, см "	Загальна розведення	Екснюк-ція, 660 нм	Одиниці активності ферменту	Вихід активності у фракції,%

2.7 Фракціонування методом диференціального центрифугування

2.7.1 Оформлення результатів

2.7.2 Аналітичне ультрацентрифугирование

Аналітичні ультрацентрифуги можуть розвивати швидкість до 70 000 об-хв -1, створюючи при цьому відцентрове прискорення до 500 000 g . Ротор у них, як правило, має форму еліпсоїда і з'єднаний за допомогою струни з мотором, що дозволяє варіювати швидкість обертання ротора. Обертається ротор у вакуумній камері, забезпеченою холодильним пристроєм, і має два відділення, аналітичну і балансуючу, які встановлюються в центрифузі суворо вертикально, паралельно осі обертання. Балансировочная осередок служить для врівноваження аналітичної і являє собою металевий блок з прецизійною системою. У ній є також два індексних отвори, що знаходяться на строго певній відстані від осі обертання, за допомогою яких визначають відповідні відстані в аналітичній осередку. Аналітична осередок, ємність якої, як правило, дорівнює 1 см 3, має секторіальних форму. При правильній установці в роторі вона, незважаючи на те що стоїть вертикально, працює за тим же принципом, що і ротор з підвісними склянками, створюючи майже ідеальні умови седиментації. На торцях аналітичної осередку є віконця з кварцовими стеклами. Аналітичні ультрацентрифуги забезпечені оптичними системами, що дозволяють спостерігати за седиментацією частинок протягом всього періоду центрифугування. Через задані проміжки часу седіментірующій матеріал можна фотографувати. При фракціонуванні білків і ДНК за седиментацією спостерігають з поглинання в ультрафіолеті, а в тих випадках, коли досліджувані розчини мають різні коефіцієнти заломлення - за допомогою шлірен-системи або інтерференційної системи Релея. Два останніх методу засновані на тому, що при проходженні світла через прозорий розчин, що складається з зон з різною щільністю, на кордоні зон відбувається заломлення світла. При седиментації між зонами з важкими і легкими частинками утворюється межа, яка діє як переломлюються лінза; при цьому на фотопластинці, що використовується в якості детектора, з'являється пік. В ході седиментації відбувається переміщення кордону, а отже, і піку, за швидкістю пересування якого можна судити про швидкість седиментації матеріалу. Інтерферометричні системи відрізняються більшою чутливістю, ніж шлірен-системи. Аналітичні осередки бувають односекторние, які застосовуються найбільш часто, і двухсекторной, які використовуються для порівняльного вивчення розчинника і розчиненої речовини.

2.8 Застосування аналітичного ультрацентрифугирования

2.8.1 Визначення молекулярних ваг

Визначення молекулярної ваги за швидкістю седиментації -це найбільш поширений метод. Центрифугування проводять при великих швидкостях, так що частинки, спочатку рівномірно розподілені по всьому об'єму, починають впорядкування переміщатися по радіусу від центру обертання. Між областю розчинника, вже вільної від часток, і тією його частиною, яка їх містить, утворюється чітка межа розділу. Ця межа при центрифугуванні переміщається, що дає можливість визначати швидкість седиментації частинок за допомогою одного з вищезазначених методів, реєструючи це переміщення на фотопластинці.

Швидкість седиментації визначається наступним співвідношенням:

де х - відстань від осі обертання в см,

t - час в с,

w - кутова швидкість в радий-с-1,

s - коефіцієнт седиментації "молекули.

Коефіцієнт седиментації - це швидкість, віднесена до одиниці прискорення, його вимірюють в одиницях Сеедберга ; 1 одиниця Сведберга дорівнює 10 _13 с. Чисельне значення s залежить від молекулярного ваги і форми частинок і є величиною, характерною для даної молекули або надмолекулярної структури. Наприклад, коефіцієнт седиментації лізоциму дорівнює 2,15 S; катав аза має коефіцієнт седиментації 11.35S, субодиниці рибосом бактерій - від 30 до 50S, а субодиниці рибосом еукаріотів - від 40 до 60S.

де М - молекулярна вага молекули, R - газова постійна, Т - абсолютна температура, s - коефіцієнт седиментації молекули, D - коефіцієнт дифузії молекули, v - парціальний питомий об'єм, який можна розглядати як обсяг, яку він обіймав одним грамом розчиненої речовини, р - щільність розчинника.

Метод седіментаціоіного рівноваги.Визначення молекулярних ваг цим методом проводиться при порівняно невеликих швидкостях обертання ротора, близько 7 000-8 000 об-хв -1, щоб молекули з великою молекулярною вагою не осідали на дно. Ультрацентрофугування проводять аж до досягнення частками рівноваги, що встановлюється під дією відцентрових сил, з одного боку, і дифузійних - з іншого, т. Е. До тих пір, поки частки не перестануть переміщатися. Потім по утворився градієнту концентрації розраховують молекулярну масу речовини "згідно з формулою

де R - газова постійна, Т - абсолютна температура, ю - кутова швидкість, р - щільність розчинника, v - парціальний питомий об'єм, з х і з 2 - концентрація розчиненої речовини на відстанях г г і г 2 від осі обертання.

де R - газова постійна, Т - абсолютна температура, v - парціальний питомий об'єм, р - щільність розчинника, dcldr - градієнт концентрації макромолекули, г м і г д - відстань до меніска і дна пробірки відповідно, з м і з д - концентрація макромолекул у меніска і у дна пробірки відповідно, М м і M R -Величина молекулярних ваг, певні за розподілом концентрації речовини у меніска і дна пробірки відповідно.

2.8.2 Оцінка чистоти препаратів

2.8.3 Дослідження конформаційних змін в макромолекулах

Формування трубчастих виробів методом центрифугування. під центрифугуванням в промисловість будівельних матеріалів ... яких здійснюється такий вплив, називаються центрифугуванням. У промисловості РБ використовуються горизонтальні центрифуги ...

осадження частинок

Лабораторна робота \u003e\u003e Хімія

Клітин, вже звільненого низькошвидкісним центрифугуванням від ядра, мітохондрій і ... ультрацентрифугирование Особливості цього типу центрифугування відображені в самому його ... для нас приклад використання центрифугування в градієнті щільності сахарози, ...

Використання центрифуги

Курсова робота \u003e\u003e Промисловість, виробництво

У центрифугах періодичної дії різні операції центрифугування - завантаження, поділ, вивантаження - відбуваються ... розрізняють препаративное і аналітичне центрифугування . при Препаративна центрифугировании вихідний біологічний матеріал беруть ...