Поняття активності ферменту

У повсякденній біохімічній практиці мало оцінюється кількість ферменту, лише його активність. Активність – ширше поняття, ніж кількість. Вона має на увазі в першу чергу результат реакції, а саме спад субстрату або накопичення продукту. Звичайно, при цьому не можна ігнорувати час, який пропрацював фермент і кількість молекул ферменту. Але оскільки число молекул ферменту підрахувати зазвичай неможливо, то застосовують кількість біологічного матеріалу, що містить фермент (обсяг чи масу).

Таким чином, при визначенні активності ферментів потрібно одночасно враховувати три змінні:

  • маса одержаного продукту або зниклого субстрату;
  • час, витрачений реакцію;
  • кількість ферменту, але насправді масу чи обсяг біологічного матеріалу, що містить фермент.

Для розуміння співвідношень зазначених факторів наочним і простим прикладомможе бути будівництво двох будинків. Будівлі прирівняємо до продукту реакції, робітники – це ферменти, бригада нехай відповідає обсягу біологічного матеріалу. Отже, завдання із 3-го класу:

  1. На будівництві однієї будівлі працювала бригада з 10 осіб, іншої такої самої будівлі - бригада з 5 осіб. Будівництво закінчено одночасно та в повному обсязі. Де вища активність робітників?
  2. На будівництві однієї будівлі з 3 поверхів працювала бригада з 10 осіб, іншої будівлі з 12 поверхів - бригада також із 10 осіб. Будівництво закінчено одночасно та в повному обсязі. Де вища активність робітників?
  3. На будівництві однієї будівлі з 5 поверхів працювала бригада з 10 осіб, іншої такої самої будівлі - бригада теж з 10 осіб. Будівництво першої будівлі зайняло 20 днів, друга збудована за 10 днів. Де вища активність робітників?

Основи кількісного визначення активності ферментів

1. Активність ферменту виражається у швидкості накопичення продукту або швидкості втрат субстрату в перерахунку на кількість матеріалу, що містить фермент.


У практиці зазвичай використовують:

  • одиниці кількості речовини - моль (та її похідні ммоль, мкмоль), грам (кг, мг),
  • одиниці часу - хвилина, година, секунда,
  • одиниці маси чи обсягу - грам (кг, мг), літр (мл).

Активно використовуються інші похідні - катал (моль/с), міжнародна одиниця активності (МЕ, Unit) відповідає мкмоль/хв.

Таким чином, активність ферменту може виражатися, наприклад, ммоль/с×л, г/час×л, МО/л, кат/мл і т. д.

Наприклад, відомо,

2. Створення стандартних умов, щоб можна було порівнювати результати, отримані в різних лабораторіях - оптимальна рН та фіксована температура, наприклад, 25°С або 37°С, дотримання часу інкубації субстрату з ферментом.

У багатьох випадках справжня молярна кількість ферменту невідома. Тому прийнято про кількість ферменту судити за швидкістю реакції, яку він каталізує за певних умов вимірювання. Визначення активності ферменту – це непряме визначенняйого кількості, оскільки швидкість ферментативної реакції пропорційна концентрації діючого ферменту.

За рішенням Комісії з ферментів Міжнародного біохімічного союзу (1961) за міжнародну одиницю активності ферменту приймається така його кількість, що каталізує перетворення 1 мікромолю субстрату за одну хвилину при 30°С (мкмоль/хв). Питому активність виражають у одиницях активності ферменту на 1 мг білка чи 1 мг препарату.

Згідно з міжнародною системою заходів (1972) рекомендована нова міжнародна одиниця активності ферменту - катал. Катал відповідає кількості ферменту, здатного викликати перетворення 1 моль субстрату на продукт за одну секунду (моль/с).

Відношення колишньої одиниці активності ферменту до каталу становить мкмоль/хв - 60 мкмоль/с - 16,67 нмоль/с. Отже, одиниця активності ферменту відповідає 1667 нкат.

Нормальне функціонування органів прокуратури та тканин організму є відбитком координованого функціонування всіх регуляторних систем, включаючи ферментні. Можна вважати, що зміна активності одного ферменту або його відсутність призводить до порушення сталості метаболізму. За будь-якої етіології хвороби, інфекційної чи інвазійної, виникають зміни активності ферментних систем, і в цьому сенсі всі хвороби розглядаються як метаболічні.

Через порушення певних ферментних систем в організмі виявлено багато хвороб тварин і людини. Так, відомі анемії, що викликаються недоліком в еритроцитах піруваткінази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, метге-моглобінредуктази. Часто патогенез патологічного процесу важко визначити. Щоб з'ясувати, яку ферментну систему порушено, слід вивчити багато факторів; потрібна тканинна біопсія, вибір відповідних діагностичних реакцій, активаторів або інгібіторів ферменту.

Необхідність визначення активності сироваткових ферментів полягає в припущенні, що зміни їх активності відбивають зміни, які у певному органі. Можна виявити у сироватці ферменти двох типів: один є специфічним для сироватки, виконуючи конкретну роль, тоді як інший тип ферменту зазвичай присутній у сироватці в дуже низькій концентрації та не несе певної функції.

При низці патологій (інсульт) можливі зміни клітинної проникності та збільшення числа зруйнованих клітин, що призводить до виходу внутрішньоклітинних ферментів у плазму. У цих випадках першими у плазмі виявляються ферменти низької молекулярної маси.

У діагностиці патології окремого органу було б ідеально визначити активність ферменту, притаманного даного органу. Однак це неможливо здійснити, оскільки метаболізм у різних органах протікає однаково. І все-таки можна встановити тканинні чи органоспецифічні ферменти, активність яких відбиває функцію певних тканин чи органів. Наприклад, підвищення активності кислої фосфатази у крові характеризує наявність пухлини простати; підвищення активності лактатдегідрогенази та креатинфосфокінази у сироватці крові є вельми інформативним діагностичним тестом, який відображає пошкодження серцевого м'яза. Збільшення активності ізоферментів ЛДГ і ЛДГ 2 у сироватці крові вказує на інфаркт міокарда, підвищення активності ЛДГ та аспартатамінотрансферази свідчить про розпад клітинних елементів у кістковому мозку. Зв'язок між активністю ферментів та патологічним процесом не завжди зрозумілий, але ці дані, безсумнівно, мають великий клінічний інтерес.

Перш ніж обговорювати властивості ферментів та залежність ферментів від будь-яких факторів необхідно визначитися з поняттям активність ферментів.

У повсякденній біохімічній практиці практично не оцінюється кількістьферменту, а лише його активність. Активність – ширше поняття, аніж кількість. Вона має на увазі в першу чергу результат реакції, а саме спад субстратуабо накопиченняпродукту.Звичайно, при цьому не можна ігнорувати час, яке пропрацював фермент і число молекулферменту. Але оскільки число молекул ферменту підрахувати зазвичай неможливо, то застосовують кількістьбіологічного матеріалу, що містить фермент (обсяг чи масу).

Таким чином, при визначенні активності ферментів потрібно одночасно враховувати три змінні:

  • масаотриманого продукту або зниклого субстрату,
  • час, витрачене на реакцію,
  • кількість ферменту, але насправді масу чи обсяг біологічного матеріалу, що містить фермент.

Для розуміння співвідношень зазначених факторів наочним і простим прикладомможе бути будівництво двох будинків. Будинкиприрівняємо до продукту реакції, робітники- Це ферменти, бригаданехай відповідає обсягу біологічного матеріалу. Отже, завдання із 3-го класу:

1. На спорудженні однієї будівлі працювала бригада з 10 осіб, іншої такої самої будівлі – бригада з 5 осіб. Будівництво закінчено одночасно та в повному обсязі. Де вища активність робітників?

2. На спорудженні однієї будівлі з 3 поверхів працювала бригада з 10 осіб, іншої будівлі з 12 поверхів – бригада також із 10 осіб. Будівництво закінчено одночасно та в повному обсязі. Де вища активність робітників?

3. На будівництві однієї будівлі з 5 поверхів працювала бригада з 10 осіб, іншої такої ж будівлі – бригада теж із 10 осіб. Будівництво першої будівлі зайняло 20 днів, друга збудована за 10 днів. Де вища активність робітників?

Основи кількісного визначення активності ферментів

1. Активність ферментувиражається в швидкостінакопичення продукту або швидкості втрат субстрату в перерахунку на кількість матеріалу, що містить фермент.

У практиці зазвичай використовують:

  • одиниці кількості речовини – моль (та її похідні ммоль, мкмоль), грам (кг, мг),
  • одиниці часу – хвилина, година, секунда,
  • одиниці маси чи обсягу – грам (кг, мг), літр (мл).

Активно використовуються інші похідні – катал (моль/с), міжнародна одиниця активності (МЕ, Unit) відповідає мкмоль/хв.

Таким чином, активність ферменту може виражатися, наприклад, ммоль/с×л, г/час×л, МО/л, кат/мл і т.д.

Наприклад, відомо,

  • що 1 г пепсинурозщеплює 50 кг яєчного білка за одну годину - таким чином, його активність складе 50 кг/год на 1 г ферменту,
  • якщо 1,6 мл слини розщеплює 175 кг крохмалю на годину – активність амілази слинискладе 109,4 кг крохмалю на годину на 1 мл слини або 1,82 кг/хв×г або 30,3 г крохмалю/мл.

2. Створення стандартних умовщоб можна було порівнювати результати, отримані в різних лабораторіях - оптимальна рН і фіксована температура, наприклад, 25°С або 37°С, дотримання часу інкубації субстрату з ферментом.

Ферменти – біологічні каталізатори, високомолекулярні речовини білкової природи, що виробляються живою клітиною. Вони суворо специфічні і грають найважливішу роль обміні речовин мікроорганізмів. Специфічність їх пов'язана з активними центрами, що утворюються групою амінокислот, тобто кожен фермент реагує з певним хімічною сполукоюабо каталізує одну або кілька близьких хімічних реакцій. Наприклад: фермент лактаза розщеплює лактозу, мальтазу - мальтозу і т.д.

Екзоферменти - виділяючись у зовнішню ере- Ендоферменти - участ-ду, розщеплюють макромолекули поживних затишок в реакціях обміну речовин до більш простих сполук, які можуть бути засвоєні мікробною клітиною (екзоферменти гідролізу викликають гідроліз жирів, білків, вуглеводів).

Ферментний склад мікроорганізмів є постійним, а різні видимікробів чітко розрізняються за набором ферментів. Тому вивчення ферментативного складу має важливе значеннядля ідентифікації різних мікроорганізмів

Практичне використання ферментативних властивостей мікробів: процеси бродіння, гриби в пивоварстві та виноробстві, обробка шкур для пом'якшення; Консервування. Приготування біодобавок до пральних порошків для видалення білкових забруднень, оскільки вони розщеплюють білки до водорозчинних.

За допомогою ферментів одержують вітаміни, гормони, алкалози.

речовин, що відбуваються усередині клітини.

ПОДИВИТИСЯ ЩЕ:

УЖиттєдіяльності бактерій ферменти відіграють важливу роль, оскільки є обов'язковими учасниками різноманітних біохімічних реакцій, що лежать в основі функцій живлення, дихання, розмноження.

Стійкість ферментативних систем бактерій дозволяє використовувати їх біохімічні властивості у поєднанні з морфологічними та культуральними ознаками для визначення видів мікроорганізмів.

Для виявлення ферментів використовують лише чисті культури мікроорганізмів, які засівають на спеціальні диференційно-діагностичні середовища. Переважне значення для дослідження біохімічної активності бактерій мають сахаролитические, протеолитические і окислювально-відновні ферменти.

Сахаралітичні ферменти бактерій.Сахаролітична активність мікроорганізмів визначається ферментативному розщепленню багатоатомних спиртів і вуглеводів при посіві їх на диференціально-діагностичні середовища. Різні види мікробів при оптимальних умовах по-різному відносяться до тих самих цукрів, розщеплюючи одні і залишаючись нейтральними по відношенню до інших. Це властивість мікробів використовується в бактеріологічній практиці для диференціації різних видів та різновидів бактерій.

На щільних, рідких і напіврідких живильних середовищах, що містять різні індикатори (найчастіше індикатор Андреде), цукри під дією сахаролітичних ферментів бактерій розщеплюються на альдегіди та кислоти. Кінцевими продуктами їхнього розщеплення є вуглекислий газта водень. Накопичення кислот знижує рН живильного середовища, що призводить до зміни кольору індикатора і середовища. Якщо бактерії не виділяють фермент до цього вуглеводу, то колір індикатора та живильного середовища не змінюється. Тому набір живильних середовищ з індикаторами називають строкатим чи кольоровим рядом.

Для виявлення сахаролітичних ферментів досліджувану культуру бактерій найчастіше засівають у кольорові середовища («строкатий ряд») гісса (рец. 15) з вуглеводами та індикатором Андреде (рец. 16) або індикатором ВР (суміш водного блакитного з розоловою кислотою). «Строкатий ряд» Гісса містить зазвичай п'ять пробірок; з глюкозою, лактозою, манітом, мальтозою та сахарозою. У деяких випадках для більш поглибленого вивчення біохімічних властивостей мікроорганізмів «строкатий ряд» гісса доповнюють дульцитом, сорбітом, ксилозою, арабінозою. Цукор, що застосовується для виявлення сахаролітичних ферментів, повинен бути хімічно чистим.

Середовища Гісса бувають рідкі та напіврідкі (з додаванням 0,5% агар-агару). У пробірки з рідкими живильними середовищами опускають бродильну трубочку (поплавець), яка є скляною трубочкою, запаяною з одного кінця. При стерилізації поплавок повністю заповнюється живильним середовищем. При утворенні серед газоподібних продуктів вони витісняють рідина з поплавця з утворенням повітряного дзвону. У напіврідких середовищах газоутворення визначають наявність бульбашок в товщі середовища.

Протеолітичні ферменти бактерій. Деякі мікроорганізми продукують та виділяють у зовнішнє середовище протеолітичні ферменти, що каталізують розщеплення білків. Внаслідок розщеплення молекули білка утворюються високомолекулярні проміжні продукти розпаду — пептони, амінокислоти та поліпептиди.

Для виявлення протеолітичних ферментів досліджувану культуру мікроорганізмів засівають у живильне середовище, що містить той чи інший білок. Найчастіше для цієї мети застосовують желатину, рідше згорнуту кінську сироватку, коагульований яєчний білок, молоко або шматочки вареного м'яса.

Для визначення протеолітичної активності мікроорганізмів на желатині готують м'ясо-пептонну желатину (рец. 17) та розливають у пробірки стовпчиком по 5-6 мл. Після застигання живильного середовища проводять посів уколом, занурюючи петлю в глибину живильного середовища до дна пробірки.

Мікроби, здатні рости за низької температури, інкубують при 20°С-22°С. Інші посіви інкубують при 37°С. При температурі 37°С желатину плавиться, тому після інкубації витягнуті пробірки поміщають у холодильник або холодну воду для застигання середовища. Після застигання середовища розпочинають перегляд результатів зростання мікроорганізмів. При виділенні протеолітичного ферменту желатинази відбувається розщеплення білків і спостерігається розрідження живильного середовища з малюнком, характерним для певних видів мікроорганізмів (рис. 37). Наприклад, сибірка паличка розріджує желатину желатину у вигляді воронки, стафілококи - у вигляді панчохи, синьогнійна паличка - пошарово і т.д.

ФЕРМЕНТАТИВНА АКТИВНІСТЬ МІКРООРГАНІЗМІВ

Різні форми розрідження желатину мікроорганізмами

Визначення протеолітичної активності бактерій на молочному агарі Ейкмана.Готують молочний агар Ейкмана, для чого до 10 мл стерильного розплавленого живильного агару додають 3 мл знежиреного молока та змішують. Молочний агар Ейкмана (рец. 18) розливають у чашки Петрі і після остигання засівають досліджуваним мікроорганізмом петлею штрихами або шпателем, щоб отримати ізольовані колонії. Через 24-48 годин інкубації в термостаті культури, що продукують протеолітичні ферменти, розкладають молочний білок - казеїн, у результаті навколо колоній утворюються чіткі прозорі зони на тлі каламутного живильного середовища.

Дата публікації: 2015-11-01; Прочитано: 1165 | Порушення авторського права сторінки

studopedia.org - Студопедія. Орг - 2014-2018 рік. (0.001 с) ...

Лекція № 3. Хімічна структура, біохімічні властивості та ферменти бактерій.

Клітина – універсальна одиниця живої матерії. За хімічним складом суттєвих відмінностей прокаріотичних та еукаріотичних клітин немає.

Хімічні елементи, що входять до складу живої матерії, можна поділити на три основні групи.

1.Біогенніхімічні елементи (З, N, H). На частку припадає 95% сухого залишку, зокрема. 50% - C, 20% - O, 15% - N, 10% - H).

2.Макроелементи- P, S, Cl, K, Mg, Ca, Na. Там припадає близько 5 %.

3.Мікроелементи- Fe, Cu, I, Co, Mo та ін На них припадають частки відсотка, проте вони мають важливе значення в обмінних процесах.

Хімічні елементи входять до складу різних речовин води, білків, ліпідів, нейтральних жирів, вуглеводів, нуклеїнових кислот. Синтез сполук контролюється генами. Багато речовин бактеріальна клітина може одержувати ззовні - з навколишнього середовища чи організму господаря.

Водастановить від 70 до 90% біомаси. Вміст води більше у капсульних бактерій, найменше-у суперечках.

Білкизустрічаються у всіх структурних елементах клітини. Білки можуть бути простіші (протеїни) і складніші (протеїди), у чистому вигляді або в комплексі з ліпідами, цукрами. Виділяють структурні (структуроутворюючі) та функціональні (регуляторні) білки, до останніх відносяться ферменти.

До складу білківвходять як звичайні для еукаріотів амінокислоти, так і оригінальні діамінопімелінова, D-аланін, D-глютанін,входять до складу пептидогліканів і капсул деяких бактерій. Тільки у суперечках знаходиться дипіколінової кислоти, З якою пов'язана висока резистентність суперечка. Джгутики побудовані з білка флагеліна, Що володіє скорочувальною здатністю та вираженими антигенними властивостями. Пили (ворсинки) містять особливий білок. пілін.

Пептидну природу мають капсули представників роду Bacillus, збудника чуми, поверхневі антигени ряду бактерій, у тому числі стафілококів та стрептококів. Білок А- Специфічний білок S.aureus - фактор, що обумовлює ряд властивостей цього збудника. Білок М- Специфічний білок гемолітичних стрептококів серогрупи А, що дозволяє диференціювати серовари (близько 100), що має епідеміологічне значення.

Ряд білків містить зовнішню мембрану грамнегативних бактерій, з яких 3 - 4 мажорних(Основних) і більше 10 - другорядних, що виконують різні функції. Серед мажорних білків- поріни, що утворюють дифузні пори, через які в клітину можуть проникати дрібні гідрофільні молекули

Білки входять до складу пептидоглікану- Біополімери, що становить основу бактеріальної клітинної стінки. Він складається з кістяка (що чергуються молекули двох аміносахарів) і двох наборів пептидних ланцюжків - бічних і поперечних. Наявність двох типів зв'язків — глікозидних (між аміносахарами) та пептидних, які з'єднують субодиниці пептидогліканів, надають цьому гетерополімеру структуру молекулярної мережі. Пептидоглікан - найбільш стійка сполука, яка утворює ригідну мішкоподібну макромолекулу, що визначає постійну форму бактерій і ряд їх властивостей..

1.Пептидоглікан містить родо- і видоспецифічні антигенні детермінанти.

2.Він запускає класичний та альтернативний шляхи активації системи комплементу.

3.Пептидоглікан гальмує фагоцитарну активність та міграцію макрофагів.

4.Він здатний ініціювати розвиток гіперчутливості уповільненого типу (ГЗТ).

5.Пептидоглікан має протипухлинну дію.

6.Вон надає пирогенное дію, тобто. викликає лихоманку.

Зі сполук білків з небілковими компонентами найбільше значеннямають ліпопротеїди, глікопротеїди та нуклеопротеїди.

Дивне таїнство життя - синтез білка здійснюється в рибосомах. Існує два основних типи рибосом - 70S (S-константа седиментації, одиниця Сведберга) та 80S. Рибосоми першого типу зустрічаються лише у прокаріотів. Антибіотики не діють на синтез білка у рибосомах типу 80S, поширених у еукаріотів.

Ліпіди(головним чином форфоліпіди) містяться в цитоплазматичної мембрані (ліпідний бішар), також у зовнішній мембрані грамнегативних бактерій. Є мікроорганізми, що містять велику кількість ліпідів (до 40% сухого залишку) – мікобактерії. До складу ліпідів входять різні жирні кислоти, дуже специфічні для різних групмікроорганізмів. Їх визначення має у ряді випадків діагностичне значення, наприклад, у анаеробів, мікобактерій.

У мікобактерій туберкульозу у складі ліпідів є ряд кислотостійких жирних кислот. фтіонова, миколевата ін Високий вміст ліпідів та їх склад визначають багато властивостей мікобактерій туберкульозу:

Стійкість до кислот, лугів та спиртів;

Важка офарблюваність барвниками (використовують спеціальні методи забарвлення, частіше за Цилю-Нільсеном);

Стійкість збудника до сонячної радіації та дезозасобів;

- Патогенність.

Тейхоєві кислотизустрічаються у клітинних стінках грампозитивних бактерій.

Є водорозчинними лінійними полімерами, що містять залишки гліцерину або рибола, пов'язані фосфодіефірними зв'язками. З тейхоевими кислотами пов'язані основні поверхневі антигени низки грампозитивних мікробів.

Вуглеводизустрічаються частіше у вигляді полісахаридів, які можуть бути екзо- та ендоклітинними. Серед екзоклітинних полісахаридів виділяють каркасні (входять до складу капсул) і екзополісахариди (виходять у зовнішнє середовище). Серед бактеріальних полісахаридів багато хто знаходить медичне застосування. Деккрани- Полісахариди з великою молекулярною масою, на вигляд нагадують слиз. 6% розчин - кровозамінник поліглюкін. Декстрановий гель сефадексвикористовується у колонковій хроматографії як молекулярне сито. Ендоклітинні полісахариди-запасні поживні речовиниклітини (крохмаль, глікоген та ін.).

Ліпополісахарид (ЛПС)— один із основних компонентів клітинної стінки грамнегативних бактерій, це з'єднання ліпіду з полісахаридом. ЛПС складається з комплексу:

1.Ліпід А.

2.Одинакове для всіх грамнегативних бактерій полісахаридне ядро.

3.Термінальний сахаридний ланцюжок ( О- специфічний бічний ланцюг).

Синоніми ЛПС-ендотоксин, О-антиген.

ЛПС виконує дві основні функції - визначає антигенну специфічність і є одним із основних факторів патогенності. Це-ендотоксин, токсичні властивості якого виявляються переважно при руйнуванні бактеріальних клітин. Його токсичність визначається ліпідом А. ЛПС запускає синтез понад 20 біологічно активних речовин, що визначають патогенез ендотоксикозу, має пірогенну дію.

Нуклеїнові кислоти- ДНК та РНК. Рибонуклеїнові кислоти(РНК) знаходяться головним чином у рибосомах (р-РНК-80-85%), т(транспортні)-РНК-10%, м(матричні)-РНК-1-2%, головним чином в одноланцюговій формі. ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота) може знаходитися в ядерному апараті (хромосомна ДНК) або в цитоплазмі в спеціалізованих утвореннях-плазмідах-плазмідна (позахромосомна) ДНК. Мікроорганізми відрізняються за структурою нуклеїнових кислот, вмістом азотистих основ. Генетичний кодскладається всього з чотирьох букв (підстав) - А (аденін), Т (тимін), Г (гуанін) і Ц (цитозин). Найчастіше для характеристики мікроорганізмів використовують як таксономічний ознака відсоткове співвідношенняГ/Ц, що суттєво відрізняється у різних груп мікроорганізмів.

Мікроорганізми синтезують різні ферменти- Специфічні білкові каталізатори. У бактерій виявлено ферменти 6 основних класів.

1.Оксидоредуктази-каталізують окислювально- відновлювальні реакції.

2.Трансферази- здійснюють реакції перенесення груп атомів.

3.Гідролази-здійснюють гідролітичне розщеплення різних сполук.

4.Ліази-каталізують реакції відщеплення від субстрату хімічної групи негідролітичним шляхом з утворенням подвійного зв'язку або приєднання хімічної групи до подвійних зв'язків.

5. Лігази або синтетази - забезпечують з'єднання двох молекул, пов'язане з розщепленням пірофосфатного зв'язку в молекулі АТФ або аналогічного трифосфату.

6. Ізомерази - визначають просторове розташування груп елементів.

Відповідно до механізмів генетичного контролю у бактерій виділяють три групи ферментів:

— конститутивнісинтез яких відбувається постійно;

- індуцибельнісинтез яких індукується наявністю субстрату;

- репресибельнісинтез яких пригнічується надлишком продукту реакції.

Ферменти бактерій ділять на екзо- та ендоферменти. Екзоферменти виділяються у зовнішнє середовище, здійснюють процеси розщеплення високомолекулярних органічних сполук. Здатність до утворення екзоферментів багато в чому визначає інвазивністьбактерій - здатність проникати через слизові, сполучнотканинні та інші тканинні бар'єри.

Приклади: гіалуронідазарозщеплює гіалуронову кислоту, що входить до складу міжклітинної речовини, що підвищує проникність тканин (клостридії, стрептококи, стафілококи та багато інших мікроорганізмів); нейрамінідазуполегшує подолання шару слизу, проникнення всередину клітин та поширення у міжклітинному просторі (холерний вібріон, дифтерійна паличка, вірус грипу та багато інших). До цієї групи належать ензими, що розкладають антибіотики.

У бактеріології для диференціації мікроорганізмів за біохімічними властивостями основне значення часто мають кінцеві продукти та результати дії ферментів. Відповідно до цього існує мікробіологічна (робоча) класифікація ферментів

1.Сахаролітичні.

2.Протеолітичні.

3.Аутолітичні.

4.Окислювально-відновні.

5.Ферменти патогенності (вірулентності).

Ферментний склад клітини визначається геномом і є досить незмінною ознакою. Знання біохімічних властивостей мікроорганізмів дозволяє ідентифікувати їх за набором ферментів. Основні продукти ферментування вуглеводів і білків - кислота, газ, індол, сірководень, хоча реальний спектр для різних мікроорганізмів набагато більший.

Основні ферменти вірулентності - гіалуронідаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейрамінідаза, ДНК-аза. Визначення ферментів патогенності має значення при ідентифікації низки мікроорганізмів та виявлення їхньої ролі в патології.

Ряд ферментів мікроорганізмів широко використовується в медицині та біології для отримання різних речовин (аутолітичні, протеолітичні), генної інженерії (рестриктази, лігази).

Попередня12345678910111213141516Наступна

ПОДИВИТИСЯ ЩЕ:

Ферменти бактерій Ферментативна активність

Ферменти бактерій Ферменти є високоспецифічними біологічними каталізаторами, без яких неможливе життя та розмноження. Велика кількістьреакцій, що відбуваються за життя бактеріальної клітини, свідчить про існування у бактерій значної кількості ферментів. Ферменти – речовини білкової природи з великою молекулярною вагою. Деякі з них відносяться до протеїнів, інші складні білки. Вони побудовані з двох частин білка та небілкової частини, яка називається простетичною групою. До її складу можуть входити вітаміни. нуклеотиди, атоми заліза та ін. Зв'язок між білковою частиною ферменту і го простетичною групою може бути міцною і неміцною. За наявності неміцного зв'язку в розчинах настає дисоціація ферменту і може звільнятися вільна простетична група.
Легко дисоціюючі та ростетичні групи ферментів називаються коферментами. Зазвичай ферменти поділяються на такі основні групи:

1. Оксидоредуктази. всі ферменти, що каталізують окисно-відновні реакції.
2. Трансферази. каталізують перенесення тих чи інших груп (наприклад аміногруп, фосфатних залишків тощо).
3.

Методи вивчення ферментативної активності бактерій.

Гідролази, що розщеплюють шляхом гідролізу Гт або інші сполуки; до цього класу відносяться також фосфатази та дезампнази - ферменти, що відщеплюють відповідно гідролітичним шляхом фосфат або амонійні групи від різних органічних сполук.
4. Ліази, ферменти, що відщеплюють від субстратів негідролітичним шляхом певні групи (наприклад, СОг, НгО, SH2 тощо).
5. Ізомерази, що каталізують внутрішньомолекулярні перебудови в субстраті.
6. Лігази (синтетази) - клас ферментів, що каталізують приєднання один до одного двох молекул з одночасним розривом ппрофосфатного зв'язку в трифосфатах (наприклад, утворюють С-О, С-N або С-S зв'язку).

Найбільш високою ферментативною активністю мають сапрофіти; меншою мірою ця властивість виражена у патогенних бактерій. Вивчення ферментів патогенних бактерій має винятково важливе значення, оскільки на підставі визначення ферментативної активності мікробів можна диференціювати різні види та визначати природу того чи іншого збудника захворювань. Поряд із цим ферментативна активність мікробів визначає патогенез та клінічну картину інфекційного захворювання.
Ферменти диференціюють на екзо та ендоферменти. Екзоферменти виділяються клітиною у зовнішнє середовище, здійснюють процеси розщеплення високомолекулярних органічних сполук більш прості, доступні для асиміляції.
Ферменти бактерій поділяються на конституїтивні та індуцибельні. До першої групи належать ті ферменти, які синтезуються бактеріальною клітиною незалежно від того, на якому середовищі бактерія вирощується. Індуцибельні ферменти продукуються цією бактерією лише у відповідь на дію специфічного індуктора, що є в середовищі.

В основі всіх метаболічних реакцій у бактеріальній клітині лежить діяльність ферментів, що належать до 6 класів: оксиредуктази, трансферази, гідролази, лігази, ліази, ізомерази. Ферменти, що утворюються бактеріальною клітиною, можуть локалізуватися як усередині клітини - ендоферменти, так і виділятися в навколишнє середовище- Екзоферменти. Екзоферменти відіграють велику роль у забезпеченні бактеріальної клітини доступними для проникнення всередину джерелами вуглецю та енергії. Більшість гідролаз є екзоферментами, які, виділяючись у навколишнє середовище, розщеплюють великі молекули пептидів, полісахаридів, ліпідів до мономерів та димерів, здатних проникнути всередину клітини. Ряд екзоферментів, наприклад гіалуронідазу, колагеназу та інші, є ферментами агресії. Деякі ферменти локалізовані у периплазматичному просторі бактеріальної клітини. Вони беруть участь у процесах перенесення речовин у бактеріальну клітину. Ферментативний спектр є таксономічною ознакою, характерною для сімейства, роду і – у деяких випадках – для видів. Тому визначення спектру ферментативної активності користуються при встановленні таксономічного положення бактерій. Наявність екзоферментів можна визначити за допомогою диференційно-діагностичних середовищ, тому для ідентифікації бактерій розроблені спеціальні тест-системи, що складаються з набору диференційно-діагностичних середовищ.

Ідентифікація бактерій щодо ферментативної активності

Найчастіше визначають ферменти класу гідролаз та оксидоредуктаз, використовуючи спеціальні методи та середовища.

Для визначення протеолітичної активності мікроорганізми засівають у стовпчик желатину уколом. Через 3-5 днів посіви переглядають та відзначають характер розрідження желатину. При розкладанні білка деякими бактеріями можуть виділятися специфічні продукти – індол, сірководень, аміак. Для їх визначення служать спеціальні індикаторні папірці, які поміщають між шийкою і ватною пробкою в пробірку з МПБ або (і) пептонною водою, засіяними мікроорганізмами, що вивчаються. Індол (продукт розкладання триптофану) забарвлює в рожевий колір смужку паперу, просоченого насиченим розчином щавлевої кислоти. Папір, просочений розчином ацетату свинцю, у присутності сірководню чорніє. Для визначення аміаку використовують червоний лакмусовий папірець.

Для багатьох мікроорганізмів таксономічною ознакою є здатність розкладати певні вуглеводи з утворенням кислот та газоподібних продуктів. Для виявлення цього використовують середовища Гісса, що містять різні вуглеводи (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу та ін.). Для виявлення кислот у середу доданий реактив Андріде, який змінює свій колір від блідо-жовтого до червоного в інтервалі рН 7,2-6,5, тому набір середовищ Гісса із зростанням мікроорганізмів називають «строкатим рядом».

Для виявлення газоутворення рідкі середовища опускають поплавці або використовують напіврідкі середовища з 0,5% агару.

Для того щоб визначити інтенсивне кислотоутворення, характерне для бродіння змішаного типу, в середу з 1% глюкози і 0,5% пептону (середа Кларка) додають метиловий індикатор червоний, який має жовтий колір при рН 4,5 і вище, і червоний - при нижчих значеннях рН.

Гідроліз сечовини визначають за виділенням аміаку (лакмусовий папірець) та підлужування середовища.

При ідентифікації багатьох мікроорганізмів використовують реакцію Фогеса – Проскауера на ацетоїн – проміжне з'єднання при утворенні бутандіолу з піровиноградної кислоти. Позитивна реакція свідчить про наявність бутандіолового бродіння.

Виявити каталазу можна по бульбашках кисню, які починають виділятися відразу після змішування мікробних клітин з 1% розчином перекису водню.

Для визначення цитохромоксидази застосовують реактиви:

1) 1% спиртовий розчин сс-нафтола-1;

2) 1% водний розчин N-диметил-р-фенілендіаміну дигідрохлориду.

Про наявність цитохромоксидази судять із синього фарбування, що з'являється через 2-5 хв.

Для визначення нітритів використовують реактив Гриса: поява червоного фарбування свідчить про наявність нітритів.

Ферментативні властивості бактерій

Для визначення сахаролітичних властивостей із вуглеводів зазвичай використовують лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, маніт. Результат реакції визначається за допомогою різних індикаторів, що додають в живильне середовище, що дають кольорові реакції. Тому метод посіву на диференціально-діагностичні середовища отримав назву посіву на строкатий ряд. Іноді, так званий довгий строкатий ряд, додають арабінозу, ксилозу, галактозу, інулін, крохмаль і ін.

При розкладанні вуглеводів відбувається утворення органічних кислот (молочної, оцтової, мурашиної) та газу (СО2 та Н2). Кислоти викликають зміну рН середовища, що призводить до зміни її кольору в результаті реакції індикатора. Утворений газ витісняє рідина у верхній частині поплавця (при використанні рідкого строкатого ряду) або викликає розрив агару (при застосуванні напіврідких цукрів).

Середовища визначення сахаролитических властивостей

Середовища Гіссаскладаються з пептонної води, 1% вуглеводу та індикатора Андреде (кислий фуксин, знебарвлений лугом). У середу опускається поплавець, який при стерилізації заповнюється середовищем. При зброджуванні цукру бактеріями колір середовища змінюється на червоний, а газ накопичується в поплавці.

Напіврідкі цукрискладаються з 0,7% м'ясопептонного агару, 1% цукру та індикатора рН (водно-блакитна фарба та розолова кислота). Посів проводиться уколом. При ферментації цукру колір середовища стає блакитним, за наявності газоутворення у процесі посіву видно бульбашки газу, сам агар розривається. У лабораторній практиці широко застосовуються й інші диференційно-діагностичні середовища, до складу яких входять цукру.

Протеолітичні властивостібактерій (розщеплення білків) визначаються виявленням кінцевих продуктів ферментації білків(індолу, сірководню, аміаку) і по здатності розріджувати желатину (м'ясопептонний бульйон з 10-15% желатин).

Розріджувати желатинуздатні мікроби, що виділяють фер-мент типу колагенази.Процес розрідження йде зверху, причому різні види мікробів дають характерну для них форму, тому ця властивість також використовується в цілях ідентифікації бактерій.

Визначення ферментації білків по кінцевих продуктах розпаду проводиться при сівбі на м'ясопептонний бульйон або пептонну воду.

Таким чином, завершуючи роботу з виділення чистої культури, ми маємо дані про морфологічні, тинкторіальні, культуральні та біохімічні властивості виділених культур бактерій. Це дає підставу приступити до видової ідентифікації – основне завдання останнього етапу бактеріологічного дослідження. І тому використовують визначник Берги. Це довідкове видання, каталог бактерій. У ньому всі мікроорганізми згруповані за основними біологічним властивостям. Порівнюючи властивості виділених культур з наведеними в опреде-лителі, встановлюють їх приналежність до групи, сімейства, роду і, нарешті, виду.

За морфологією, типом дихання, тинкторіальними властивостями, здатністю до спороутворення знаходять таксономічну групу для ідентифікованої культури. За повними морфологічними, тинкторіальними властивостями, типом дихання, спороутворенням, культуральними властивостями і деякими біохімічними ознаками знаходять сімейство, за методологічними особливостями (наявність капсул, джгутиків і т.д.), культуральним і біохімічним ознаками визначають рід, а внут- ри роду за біохімічними та антигенними властивостями встановлюють вид.

Самостійна робота студента

На практичному занятті

Контрольні питання

1. Харчування бактерій: аутотрофи та гетеротрофи.

2. Класифікація поживних середовищ.

3. Умови культивування бактерій.

4. Вимоги до поживних середовищ.

5. Хімічний складбактерій.

6. Поняття про чисту культуру та колонії.

7. Методи виділення чистих культур аеробних бактерій.

8. Етапи виділення чистої культури аеробних бактерій.

9. Культуральні властивості бактерій.

10. Біологічне окислення у аеробних та анаеробних бактерій.

11. Методи культивування анаеробів.

12. Методи виділення чистих культур анаеробів.

13. Значення ферментів для ідентифікації бактерій.

Тема: «Вплив чинників довкілля на мікроорганізми. Дія фізичних та хімічних факторів. Стерилізація та дезінфекція»

Ціль:

– навчитися методам стерилізації лабораторної судини та

поживних середовищ.

Завдання:

– вміти правильно підібрати відповідний метод стерилізації

різних об'єктів (середовище, посуд, інструменти тощо);

- освоїти основні групи дезінфікуючих речовин і механізм

їх дії на бактерії.

У зовнішньому середовищі на мікроби діють фізичні, хімічні та біологічні фактори, які або пригнічують, або стимулює їхню життєдіяльність.

До фізичним факторам відносяться: висока і низька температура, висушування, промениста енергія, ультразвук, високий тиск.

Температура. Фізіологічна діяльність будь-якого мікроорганізму пристосована до певного температурного оптимуму. По відношенню до температури всі мікроорганізми поділяються на психрофіли(від 0 до +10 ° С), мезофіли(від +20°С до +40°С) та термофіли(+50 ° С – +70 ° С). Більшість патогенних мікроорганізмів належить до мезофілів.

Більшість мікроорганізмів стійкі до низьких температур (виняток становлять гонококи та менінгококи).

Ферментативна активність бактерій

Висока температура (+50°С – +60°С) згубно діє вегетативні форми бактерій. Суперечки витримують кип'ятіння до 2 годин. Згубна дія високої температури лежить в основі методів стерилізації.

Основні протиепідемічні заходи

В лабораторії

Стерилізація

Стерилізація – видалення чи знищення всіх живих мікроорганізмів (вегетативних та спорових форм) усередині або на поверхні предметів.

Стерилізація проводиться різними методами: фізичними, хімічними, механічними.

Основні вимоги до процесу стерилізації відображені у галузевому стандарті 42-21-2-82 «Стерилізація та дезінфекція виробів медичного призначення. Методи, засоби, режими».

Фізичні методи

Найпоширенішим методом стерилізації є дія високої температури. При температурі, що наближається до 100 °С, загибель більшості патогенних бактерій і вірусів. Суперечки ґрунтових бактерій-термофілів гинуть при кип'ятінні протягом 8,5 годин. Мікроорганізми, що потрапили в глибинні шари землі, або покриті кров'ю, що згорнулася, виявляються захищеними від впливу високої температури і зберігають свою життєздатність.

При стерилізації фізичними методамизастосовують дію високих температур, тиску, ультрафіолетового опромінення та ін.

Найпростіший, але надійний вид стерилізації — прожарювання. Його застосовують при поверхневій стерилізації негорючих та теплостійких предметів безпосередньо перед їх використанням.

Іншим простим і легко доступним методом стерилізації вважається кип'ятіння. Цей процес проводять в стерилізаторі - металевій коробці прямокутної форми з двома ручками і кришкою, що щільно закривається. Усередині розташована металева сітка, що виймається, з ручками з боків, на яку кладуть стерилізований інструмент. Основний недолік методу у тому, що не знищує суперечки, лише вегетативні форми.

При паровій стерилізації необхідно виконання певних умов, які гарантують її ефективність та збереження стерильності виробів протягом певного терміну. Насамперед стерилізація інструментів, операційної білизни, перев'язувального матеріалу повинна проводитися в упаковці. З цією метою використовують: стерилізаційні коробки (бікси), подвійне м'яке пакування з бязі, пергамент, вологоміцний папір (крафт-папір), поліетилен високої щільності.

Обов'язкова вимога до упаковки – герметичність. Терміни збереження стерильності залежать від виду упаковки і становлять три доби для виробів простерилізованих у коробках без фільтрів, у подвійній м'якій упаковці з бязі, паперу мішкової вологоміцної. У стерилізаційних коробках із фільтрами стерильність виробів зберігається протягом року.

Стерилізація сухим жаром

Процес стерилізації сухим жаром проводять у сухожаровій шафі (у печі Пастера та ін) - металевій шафі з подвійними стінками. У корпусі шафи розташовані робоча камера, в якій є полиці для розміщення предметів для обробки, та нагрівальні елементи, які служать для рівномірного нагрівання повітря у робочій камері.

Режими стерилізації:

температура 150 ° С - 2 години;

температура 160 ° С - 170 ° С - 45 хвилин - 1 година;

температура 180 ° С – 30 хвилин;

температура 200 ° С - 10-15 хвилин.

Необхідно пам'ятати, що при температурі 160 ° С папір і вата жовтіють за вищої температури - згоряють (обвуглюються). Початком стерилізації є той момент, коли температура печі досягає потрібної величини. Після закінчення стерилізації піч вимикається, прилад остигає до 50 ° С, після чого з нього виймають простерилізовані предмети.

Вироби в повітряному стерилізаторі можна стерилізувати без упаковки, але тільки в тих випадках, якщо вони використовуються відразу після стерилізації. Як упаковка може бути використаний папір мішковий, виготовлений за ГОСТ 2228-81, в ньому вироби зберігаються не менше 3-х діб.

Режим повітряної стерилізації представлений двома значеннями температури - 160 ° С протягом 2,5 години, або 180 ° С - протягом 1 години.

Стерилізація текучою парою

Цей вид стерилізації виробляється в апараті Коха або в автоклаві при кришці і відкритому випускному крані. Апарат Кохає металевий порожнистий циліндр з подвійним дном. Стерилізований матеріал завантажують в камеру апарата не щільно, щоб забезпечити можливість найбільшого контакту його з парою. Початковий підігрів води у приладі відбувається протягом 10-15 хвилин.

Поточною парою стерилізують матеріали, які розкладаються або псуються при температурі вище 100 ° С - живильні середовища з вуглеводами, вітамінами, розчини вуглеводів і т.п.

Стерилізацію текучою парою проводять дробовим методом - при температурі не вище 100 оС по 20-30 хвилин протягом 3-х днів. При цьому вегетативні форми бактерій гинуть, а суперечки зберігають життєздатність і проростають протягом доби за кімнатної температури. Подальше прогрівання забезпечує загибель цих вегетативних клітин, що виникають із суперечок у проміжках між етапами стерилізації.

Тиндалізація- метод дробової стерилізації, при якому прогрівання матеріалу, що стерилізується проводиться при температурі 56-58 оС протягом години 5-6 днів поспіль.

Пастеризація- Одноразове нагрівання матеріалу до 50-65 ° С (протягом 15-30 хвилин), 70-80 ° С (протягом 5-10 хвилин). Використовується для знищення безспорових форм мікробів у харчових продуктах(молоко, соки, вино, пиво).

Попередня1234567891011121314Наступна

Поняття про ферменти

Ферментами (ензимами)називають розчинні чи пов'язані з мембранами білки, наділені каталітичної активністю. (Крім білків каталітичну активність в організмі можуть проявляти деякі РНК (рибозими) і антитіла (абзими), проте вони в тисячі разів менш ефективні, ніж ферменти. . Вони нагадують перші джерела ферментів. Біохімії, яка вивчає ферменти, називається ензимологія. На схемах і рівняннях реакцій молекули ферментів позначають - Е. Речовини, перетворення яких каталізують ферменти, називають субстратами (S). Продуктиензиматичної реакції позначають - Р. Оскільки ферменти є білками, їх одержують у гомогенному вигляді тими самими способами, що й інші білки. Для ферментів характерні фізико-хімічні властивості, властиві білкам.

Відмінність ферментів від неорганічних каталізаторів:

а) прискорюють реакції значно ефективніше;

б) наділені високою специфічністю дії;

в) піддаються регуляції у фізіологічних умовах;

г) діють у м'яких умовах.

Будова ферментів

Ферментами можуть бути як прості, так і складні (кон'юговані) білки, до складу яких можуть входити ліпіди, вуглеводи, іони металів, азотисті основи, похідні вітамінів. В організмі ферменти можуть функціонувати як у розчинному стані, так і у вигляді нерозчинних комплексів або входити до складу біологічних мембран.

Відмінною рисоюферментів є наявність активного центру. Активний центр -це унікальна комбінація зближених у просторі амінокислотних залишків, яка забезпечує:

а) впізнавання молекули субстрату,

б) зв'язування субстрату з ферментом,

в) здійснення каталітичного перетворення (у разі складного ферменту в акті каталізу також бере участь кофермент, що входить до складу активного центру).

Активний центр виникає тоді, коли білок згортається і приймає свою нативну (активну) конформацію. Структура активного центру може бути змінена при взаємодії з субстратом. За образним виразом Д. Кошланд субстрат підходить до активного центру як рука до рукавички.

Одна молекула ферменту, особливо якщо вона складається з кількох субодиниць, може містити більше активного центру.

В активному центрі є дві ділянки. Перша ділянка відповідає за впізнавання та зв'язування субстрату. Він називається субстрат-зв'язуючим ділянкою або якірним майданчиком. Друга ділянка називається каталітичною, до її складу входять амінокислотні залишки, що беруть участь в акті каталізу.

Ферменти представляють білки, що сильно розрізняються за молекулярною масою та складністю будови. Прикладом ферменту з невеликою молекулою є рибонуклеаза, що складається з однієї субодиниці з молекулярною масою 13700 Да. (У рибонуклеази визначена амінокислотна послідовність. У 1969 р. рибонуклеаза була синтезована в лабораторії Б. Мерріфілда в Нью-Йорку.) Багато ферментів складаються з декількох субодиниць, наприклад, лактатдегідрогеназа складається з чотирьох субодиниць двох видів. На цей час відомо кілька мультиферментних комплексів, які з десятків різних субодиниць і кілька типів коферментів. Наприклад, піруватдегідрогеназний комплекс складається з 60 субодиниць трьох типів та п'яти типів кофакторів. Молекулярна маса такого комплексу становить 2,3 * 10 6 - 10 * 10 6 Так залежно від джерела ферменту. Молекула ферменту може бути меншою, ніж молекула субстрату. Наприклад: молекули ферментів амілази та рибонуклеази менші, ніж молекули їх субстратів – крохмалю та РНК.

Білкова частина складних ферментів каталітично неактивна і називається апоферментом. Зв'язування апоферменту з небілковим компонентом призводить до утворення каталітично активного ферменту (холоферменту):

Багато ферментів містять у своєму складі іон металу, який може виконувати різні функції:

а) брати участь у зв'язуванні субстрату та процесі його каталітичного перетворення;

б) сприяти приєднанню коферменту до молекули ферменту;

в) стабілізувати третинну структуру ферменту (наприклад, Са 2+ в амілазі);

г) зв'язуючись із субстратом, утворювати справжній субстрат, на який діє фермент.

Багато коферментів є похідними вітамінів, тому порушення обміну речовин при вітамінній недостатності обумовлено зниженням активності певних ферментів.

Деякі ферменти поряд з активним центром містять алостеричний (регуляторний) центр -ділянка білкової глобули, поза активним центром, де можуть зв'язуватися речовини, що регулюють ферментативну активність. Ці речовини називають алостеричними ефекторами (алостеричними активаторами або інгібіторами). Внаслідок зв'язування ефектора з алостеричним центром відбувається зміна структури білка, що призводить до зміни просторового розташування амінокислотних залишків в активному центрі і, в результаті, зміни ферментативної активності.

Ферменти, що зустрічаються в одному організмі та каталізують одну й ту саму хімічну реакцію, але з різною первинною структурою білка, називаються ізоферментами. Ізоферменти відрізняються один від одного за такими фізико-хімічними властивостями, як молекулярна маса, термостабільність, субстратна специфічність, електрофоретична рухливість Природа появи ізоферментів різноманітна, але найчастіше зумовлена ​​відмінностями у структурі генів, що кодують ці ізоферменти або їх субодиниці. Наприклад, фермент лактатдегідрогеназу (ЛДГ), що каталізує оборотну реакцію окислення лактату до пірувату, має чотири субодиниці двох типів М і Н, комбінація цих субодиниць лежить в основі формування п'яти ізоферментів ЛДГ (рис.1). Для діагностики захворювань серця та печінки необхідне дослідження ізоферментного спектру ЛДГ у сироватці крові, оскільки ЛДГ 1 та ЛДГ 2 активні у серцевому м'язі та нирках, а ЛДГ 4 та ЛДГ 5 – а скелетних м'язах та печінці.

Рис.1 Будова різних ізоферментів ЛДГ.

Вимірювання ферментативної активності

Визначення активності ферментів здійснюється шляхом вимірювання швидкості реакцій, що каталізуються. Швидкість ферментативних реакцій вимірюють за зменшенням концентрації субстрату або збільшення концентрації продукту за одиницю часу:

v = -ΔС S /Δτ , v = ΔC P /Δτ ,

де ΔС S- Зміна молярної концентрації субстрату (моль/л),

ΔC P- Зміна молярної концентрації продукту реакції (моль/л),

Δτ – зміна часу (хв, сек).

Кінетичні дослідження бажано проводити при насичувальній концентрації субстрату, в іншому випадку фермент не матиме змоги проявити максимальну активність.

Одиниці активності ферментів:

Міжнародна одиниця ферменту (U)- це така кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хвилину при температурі 25 про С та оптимальному рН середовища.

У системі СІ одиницею ферменту є катал (кат)-Це така кількість ферменту, що каталізує перетворення одного мольсубстрату за 1 секунду. Неважко підрахувати, що:

1 U = (1 * 10 -6 М) / 60 с = 1,67 * 10 -8 М с-1 = 1, 67 * 10 -8 кат = 16,7 нкат.

Часто визначають питому активністьпрепаратів ферменту розподілом активності навішування препарату ферменту, вираженої в (U), на масу навішування в міліграмах:

А уд = U/маса препарату (мг)

При очищенні ферментів питома активність зростає. За зростанням питомої активності можна судити про ефективність стадій очищення та чистоту ферментного препарату.

Для оцінки активності високоочищених, гомогенних препаратів ферментів розподілом числа міжнародних одиниць (U) ферменту у зразку на кількість речовини ферменту (мкмоль) у цьому зразку розраховують молярну активність(число обертів). за фізичного змістумолярна активність - це число молекул субстрату, що піддаються перетворенню на одній молекулі ферменту за 1 хвилину або за 1 секунду. Наприклад: для уреази, що прискорює гідроліз сечовини, молярна активність становить 30000, трипсину – 102, глюкозоксидази – 17000 циклів на секунду.

Властивості ферментів

4.1. Механізм дії.Ферменти не зміщують рівновагу реакцій, що каталізуються, у бік утворення продуктів, таким чином, константа рівноваги реакції залишається постійною. Як і всі каталізатори, ферменти лише зменшують час досягнення цієї рівноваги. Найчастіше ферменти прискорюють реакції в 10 7 - 10 14 разів. В основі ефективності ферментативного каталізу лежить сильне зниження енергії активації реакції за рахунок перетворення субстрату на продукт через перехідні стани.

4.2. Специфіка дії. Специфічність зв'язування з субстратом та шляхи протікання ферментативної реакції визначаються апоферментом. Специфіка дії ферментів визначає спрямований обмін речовин в організмі.

Про ферменти говорять, що вони мають вузьку субстратну специфічністьякщо вони діють на дуже невелике коло субстратів. Іноді можна говорити про абсолютної субстратної специфічності,наприклад, каталаза каталізує лише одну реакцію - розкладання пероксиду водню:

Для більшості ферментів характерна відносна (широка, групова) субстратна специфічністьколи вони каталізують групу однотипних реакцій. Наприклад, алкогольдегідрогеназа каталізує перетворення спиртів на альдегіди, причому як субстрати можуть виступати метанол, етанол, пропанол та інші спирти. Цікавим є той факт, що алкогольдегідрогеназа може окислювати і нелінійні спирти, а також спиртову групу, що входить до складу складних молекул, зокрема, цей фермент може каталізувати перетворення ретинолу на ретиналь. Звичайно, ферменти, наділені широкою субстратною специфічністю, каталізують перетворення субстратів з різною ефективністю.

Ферменти наділені також стереохімічною специфічністю: їх активний центр розпізнає молекули субстратів щодо просторової конфігурації. Наприклад, оксидази L-амінокислот активні лише щодо L-амінокислот і зовсім не діють на їх D-аналоги. Для окисного дезамінування D-амінокислот у живих організмах є оксидази D-амінокислот, що не діють на L-амінокислоти. Саме здатність активного центру зв'язуватися з певними стереоізомерами субстрату є основою функціонування таких ферментів, як рацемази, які перетворюють одні стереоізомери на інші.

Специфіка шляхів перетворенняполягає в тому, що один субстрат під дією різних ферментів може перетворюватися на продукти, що розрізняються за структурою та роллю в метаболізмі.

Наведемо приклад: оксидази L-амінокислотдіють на L-амінокислоти, перетворюючи їх на альфа-кетокислоти з утворенням аміаку та пероксиду водню.

Декарбоксилази L-амінокислотзв'язуються з тими ж субстратами, але каталізують іншу реакцію: декарбоксилювання з утворенням біогенних амінів та виділенням вуглекислого газу.

Ще одним прикладом є можливість перетворення глюкозо-6 фосфату під дією різних ферментів, по одному з можливих метаболічних шляхів:

4.3. Термолабільність .

Як і багато білків, при підвищенні температури ферменти піддаються термічній денатурації, що призводить до порушення нативної конформаціїферменту та зміни структури активного центру. Ферменти ссавців починають помітно денатурувати за температур вище 40 про З.

У зв'язку з вищесказаним ферментні препарати бажано зберігати при знижених температурах. Одним з кращих шляхів збереження ферментів є їх ліофілізація (висушування при температурі нижче -70 про С у вакуумі), переведення в частково денатурований стан за допомогою амонію солей і приміщення в холодильник.

4.4. Залежність швидкості реакції від температури.Швидкість ферментативних реакцій, як будь-яких хімічних реакцій, залежить від температури. При підвищенні температури на 10 про З швидкість реакції збільшується в 2-4 рази згідно з правилом Вант-Гоффа. Однак при температурах вище 40 о С істотною стає денатурація ферментів, що призводить до зменшення сумарної активності (рис. 2):

Мал. 2. Залежність швидкості ферментативної реакції від температури.

4.5. Залежність швидкості реакції від рН.Залежність швидкості ферментативної реакції від рН має дзвоноподібний вигляд (рис. 3). Значення рН, у яких спостерігається найвища швидкість ферментативної реакції, називають оптимальними (рН-оптимум). Характер кривих та значення рН-оптимуму залежить від природи заряджених груп субстрату та заряджених груп ферменту (особливо тих, що входять до активного центру). Оптимум рН більшість ферментів лежить у межах від 6,0 до 8,0 (рис. 3).

Мал. 3. Залежність швидкості ферментативної реакції від рН.

Однак є і винятки, наприклад, пепсин найбільш активний при рН 1,5 - 2,0, а лужна фосфатаза при рН 10,0 - 10,5 (рис. 4)

Мал. 4. Залежність швидкості ферментативної реакції (v) від рН середовища.

При екстремальних (надто низьких або дуже високих) значеннях рН відбувається порушення третинної структури молекули ферменту, що призводить до втрати ферментативної активності.


Подібна інформація.