Principiul fracționării centrifugării. Centrifugarea. Determinarea greutăților moleculare

Pe lângă filtrare, separarea unui amestec de substanțe lichide și solide este posibilă și prin centrifugare, adică separarea substanțelor în dispozitive numite centrifuge.

Centrifuga se bazează pe utilizarea forței centrifuge... În timpul rotației rapide (centrifugare), particulele solide suspendate într-un lichid (cu o "densitate mai mare decât densitatea lichidului), sub acțiunea forței centrifuge care se dezvoltă în timpul rotației, sunt aruncate departe de centru și astfel separate de lichid .

Orez. 407. Aparat Thyssen pentru munca microanalitică

Orez. 408. Centrifugă manuală

Există centrifuge: deschise și închise, cu acționare manuală și mecanică. Partea principală a unei centrifuge manuale deschise (Fig. 408) este o axă rotativă poziționată vertical, perpendiculară la care la capătul superior este atașată o bară cu două (sau patru) manșoane metalice montate mobil. În aceste manșoane, se introduc tuburi speciale, îngustate în jos (Fig. 409) cu un lichid din care trebuie îndepărtate particulele suspendate,

O bucată de vată este plasată în partea de jos a mânecii, „pentru a evita contactul direct al sticlei cu metalul. Când tuburile sunt introduse în manșoane, centrifuga este pusă în mișcare și după un timp (în funcție de vâscozitatea lichidului, dimensiunea particulelor suspendate și diferența de densitate), solidele suspendate sunt separate de lichid, după care centrifuga este oprită. În partea de jos a eprubetei, se colectează un sediment solid dens, peste care există un lichid limpede.

Z centrifuge de interior(Fig. 410), în funcție de dimensiune, conține un număr diferit de manșoane, de la 2 la 12 și mai mult, situate simetric la aceeași distanță una de cealaltă și de axa centrifugii.

Centrifuge mecanice închise(Fig. 410, b) sunt mai convenabile decât cele manuale (Fig. 410, a). De obicei dau 2000-3000 rpm, permit realizarea unei separări mai perfecte a materiei lichide și solide.

Tuburile de centrifugare după umplerea cu lichid ar trebui să aibă aceeași masă. În cazul în care centrifuga trebuie folosită frecvent, se recomandă să aveți o balanță specială adaptată pentru cântărirea (sau mai bine zis, tararea) eprubetelor. În cântarele indicate, cupele sunt suspendate de grindă prin intermediul unor tije atașate la centrul cupelor. Aceste tije au inele în care sunt introduse tuburile.

După ce ați întărit tuburile, turnați mai întâi lichidul care trebuie centrifugat într-un tub (folosind, de exemplu, o pipetă), apoi în cel de-al doilea, realizând echilibrarea plăcilor.

Prea mult lichid nu trebuie turnat niciodată în tuburi; tuburile sunt umplute astfel încât distanța de la margine la nivelul lichidului să nu fie mai mică de 10 mm.

Atunci când multe tuburi trebuie echilibrate, se recomandă următoarea tehnică. După ce a echilibrat prima pereche de tuburi, unul dintre ele este scos și plasat în puțul centrifugii, iar celălalt este lăsat pe balanță; această ultimă eprubetă va servi ca etalon pentru restul; introduceți o altă eprubetă în locul liber de pe balanță, echilibrați-o cu etalonul și scoateți-o. De asemenea, se recomandă umplerea prealabilă a eprubetelor (luând cantitatea de lichid puțin mai mică decât cea necesară) și adăugând cantitatea necesară de lichid în timp ce se echilibrează. Această tehnică grăbește munca.

Orez. 409. Tuburi pentru centrifuge.

Tuburile echilibrate sunt introduse în prizele centrifugei.

Centrifuga nu trebuie pornită imediat la viteză maximă, ci treptat. Acest lucru se aplică atât centrifugelor manuale, cât și celor mecanice.

Orez. 410. Centrifugele închise: a - cu acționare manuală; b - cu un motor electric.

Centrifugele mecanice sunt echipate cu dispozitive de control al vitezei adecvate. Astfel, centrifugele electrice sunt echipate cu reostate pentru comutarea treptată la viteză maximă. La centrifugele acționate de o turbină cu apă, se obține o creștere treptată a vitezei prin reglarea fluxului de apă. Cu cât comutarea a fost efectuată cu mai multă atenție, cu atât funcționează mai fiabil centrifuga.

Centrifuga trebuie monitorizată constant; contaminarea acestuia, în special a părților în mișcare, este inacceptabilă. Manșoanele metalice trebuie să se rotească liber și ușor. Angrenajele care conduc centrifuga trebuie să fie ușor de deplasat; nu trebuie lubrifiați cu grăsimi care se pot îngroșa. De asemenea, arborele centrifugii trebuie să fie în ordine și întotdeauna curat.

În cazul manipulării nepăsătoare a centrifugelor, în special a celor manuale, este posibilă îndoirea osiei și astfel deteriorarea centrifugii.

După oprirea centrifugii, samorul este lăsat să se oprească și numai atunci tuburile sunt scoase.

Recent, așa-numitele supercentrifuge, cu o viteză de până la 40.000 rpm, au început să câștige din ce în ce mai multă distribuție (Fig. 411).

Orez. Supercentrifugă 411

Astfel de centrifuge sunt potrivite în special pentru centrifugarea a tot felul de soluții vâscoase, cum ar fi lacuri, dispersii fine și emulsii.

Lichidul care trebuie supercentrifugat intră în conducta de ramificare 1 situată în partea inferioară a aparatului. Apoi, lichidul este turnat în cilindrul de lucru 2, rotind cu o viteză de până la 40.000 rpm, în care mai multe particule grele suspendate în lichid sunt separate. Lichidul crește treptat de-a lungul cilindrului 2 până la separatorul 5 și, dacă emulsia este distrusă, atunci lichidul mai ușor curge prin scurgerea 8, iar cel mai greu - de-a lungul scurgerii 4. Când particulele solide cu o densitate mai mare de unitatea este separată, lichidul curge prin canalul de scurgere 3. Pe peretele interior se depune un sediment solid detașabil pe cilindrul de lucru. Supercentrifugă. Din când în când, supercentrifuga este oprită, cilindrul de lucru 2 este îndepărtat, este curățat de sedimente și, din nou pus, se continuă lucrarea. Întregul proces de curățare a cilindrului de lucru, de la momentul opririi până la momentul repornirii supercentrifugei, nu durează mai mult de 15 minute. Dacă este necesar să se purifice cantități relativ mari de lichid, atunci acestea folosesc trei supercentrifugi: una funcționează, cealaltă este purificată, a treia este în rezervă,

Munca cursului

Centrifugarea

1. Principiul metodei

Separarea substanțelor prin centrifugare se bazează pe comportamentul diferit al particulelor într-un câmp centrifugal. O suspensie de particule, plasată într-o eprubetă, este încărcată într-un rotor montat pe arborele de antrenare al centrifugii.

Într-un câmp centrifugal, particulele de diferite densități, forme sau dimensiuni sunt depuse la viteze diferite. Viteza de sedimentare depinde de accelerația centrifugă, care este direct proporțională cu viteza unghiulară a rotorului și distanța dintre particulă și axa de rotație:

iar accelerația centrifugă va fi apoi egală)

Deoarece o rotație a rotorului este de 2n radiani, viteza unghiulară a rotorului în rotații pe minut poate fi scrisă după cum urmează:

Accelerarea centrifugă este de obicei exprimată în unități de g și se numește accelerare centrifugă relativă, adică

Când enumerați condițiile de separare a particulelor, indicați viteza de rotație și raza rotorului, precum și timpul de centrifugare. Accelerația centrifugă este de obicei exprimată în unități de g, calculate din raza medie de rotație a unei coloane de lichid într-un tub de centrifugă. Pe baza ecuației, Dole și Kotzias au compilat o nomogramă care exprimă dependența OCP de viteza și raza rotorului r.

Viteza de sedimentare a particulelor sferice depinde nu numai de accelerația centrifugă, ci și de densitatea și raza particulelor în sine și de vâscozitatea mediului de suspensie. Timpul necesar pentru ca o particulă sferică să se stabilească într-un mediu lichid de la meniscul lichidului la fundul tubului centrifugii este invers proporțional cu viteza de sedimentare și este determinată de următoarea ecuație:

unde t este timpul de sedimentare în secunde, rj este vâscozitatea mediului, rh este raza particulei, rp este densitatea particulei, p este densitatea mediului, gm este distanța de la axa de rotație la meniscul lichidului, rd este distanța de la axa de rotație până la fundul eprubetei.

După cum urmează din ecuație, la o viteză dată a rotorului, timpul necesar depunerii particulelor sferice omogene este invers proporțional cu pătratul razelor lor și diferența dintre densitățile particulelor și mediul și este direct proporțională cu vâscozitatea a mediului. Prin urmare, un amestec de particule eterogene, aproximativ sferice, care diferă în densitate și dimensiune, poate fi separat fie datorită timpului lor de decantare diferit pe fundul tubului la o anumită accelerație, fie datorită distribuției particulelor de sedimentare de-a lungul tubului, care se stabilește după o anumită perioadă de timp. La separarea substanțelor, este necesar să se ia în considerare factori atât de importanți precum densitatea și vâscozitatea mediului. Metodele descrise pot separa organitele celulare de omogenatele tisulare. Componentele principale ale unei celule sunt depuse în următoarea secvență: mai întâi, celule întregi și fragmentele lor, apoi nuclei, cloroplaste, mitocondrii, lizozomi, microsomi și, în final, ribozomi. Depunerea particulelor non-sferice nu respectă ecuația, deci particulele de aceeași masă, dar de diferite forme se instalează la viteze diferite. Această caracteristică este utilizată în studii care utilizează ultracentrifugarea conformației macromoleculelor.

Centrifugarea preparativă constă în izolarea materialului biologic pentru ulterior cercetare biochimică... În acest caz, este posibil să se ia cantități mari de material biologic inițial, de exemplu, inoculări de celule microbiene din culturi discontinue sau continue, precum și inoculări de celule vegetale și animale din țesuturi și plasmoculturi. Centrifugarea preparativă este utilizată pentru a izola un numar mare de particule celulare pentru a-și studia morfologia, structura și activitatea biologică. Metoda este, de asemenea, utilizată pentru a izola macromoleculele biologice, cum ar fi ADN-ul și proteinele din preparatele pre-purificate.

Centrifugarea analitică este utilizată în principal pentru a studia preparatele pure sau aproape pure de macromolecule sau particule, cum ar fi ribozomii. În acest caz, se utilizează o cantitate mică de material, iar sedimentarea particulelor investigate este înregistrată continuu utilizând sisteme optice speciale. Metoda permite obținerea de date privind puritatea, greutatea moleculară și structura materialului. În atelierele pentru studenți, centrifugarea pregătitoare este utilizată mult mai des decât centrifugarea analitică, așa că ne vom opri asupra ei mai detaliat, deși ambele metode se bazează pe principii generale.

2. Centrifugarea preparativă

2.1 Centrifugarea diferențială

Această metodă se bazează pe diferențe în ratele de sedimentare ale particulelor care diferă între ele prin mărime și densitate. Materialul care trebuie separat, de exemplu un omogenizat tisular, este centrifugat cu o creștere treptată a accelerației centrifuge, care este selectată astfel încât, în fiecare etapă, o anumită fracțiune să fie depusă pe fundul tubului. La sfârșitul fiecărei etape, precipitatul este separat de supernatant și spălat de mai multe ori pentru a obține în cele din urmă o fracție de precipitat pur. Din păcate, este aproape imposibil să obții un sediment absolut pur; pentru a înțelege de ce se întâmplă acest lucru, să trecem la analiza procesului care are loc într-un tub de centrifugă la începutul fiecărei etape de centrifugare.

La început, toate particulele omogenatului sunt distribuite uniform pe tot volumul tubului de centrifugă, prin urmare, este imposibil să se obțină preparate pure din sedimentele celor mai grele particule într-un singur ciclu de centrifugare: primul sediment format conține în principal cele mai grele particule , dar, în plus, o parte din toate componentele inițiale. O preparare suficient de pură a particulelor grele poate fi obținută numai prin resuspendare și centrifugare a sedimentului original. Centrifugarea suplimentară a supernatantului, cu o creștere ulterioară a accelerației centrifuge, conduce la sedimentarea particulelor de dimensiuni și densitate medie și apoi la sedimentarea celor mai mici particule cu densitatea cea mai mică. În fig. 2.3 prezintă schema de fracționare a omogenatului de ficat de șobolan.

Centrifugarea diferențială este probabil cea mai obișnuită metodă pentru izolarea organelor celulare de omogenatele tisulare. Această metodă este utilizată cu cel mai mare succes pentru separarea unor astfel de organite celulare, care diferă semnificativ între ele prin mărime și densitate. Dar chiar și în acest caz, fracțiile rezultate nu sunt niciodată complet omogene, iar alte metode descrise mai jos sunt utilizate pentru separarea lor ulterioară. Aceste metode, bazate pe diferențe de densitate a organelor, asigură o separare mai eficientă datorită faptului că centrifugarea se efectuează în soluții cu un gradient de densitate continuu sau treptat. Dezavantajul acestor metode este că este nevoie de timp pentru a obține gradientul de densitate al soluției.

2.2 Centrifugarea zonei de viteză

Metoda vitezei zonale sau, așa cum se mai numește, centrifugarea s-zonală, constă în stratificarea unei probe de testare pe suprafața unei soluții cu un gradient continuu de densitate. Apoi proba este centrifugată până când particulele sunt distribuite de-a lungul gradientului sub formă de zone sau dungi discrete. Prin crearea unui gradient de densitate, se evită amestecarea zonelor datorită convecției. Metoda centrifugării cu viteză zonală este utilizată pentru a separa hibrizii ARN-ADN, subunitățile ribozomilor și alte componente celulare.

2.3 Centrifugarea izopicnică

Centrifugarea izopicnică se efectuează atât într-un gradient de densitate, cât și în mod obișnuit. Dacă centrifugarea nu se efectuează într-un gradient de densitate, preparatul este mai întâi centrifugat astfel încât particule cu o greutate moleculară mai mare decât cea a particulelor studiate. Aceste particule grele sunt aruncate, iar eșantionul este suspendat într-un mediu a cărui densitate este aceeași cu cea a fracției care urmează să fie izolată și apoi centrifugată până când particulele de interes se așează pe fundul tubului și particulele cu densitate mai mică plutesc la suprafața lichidului ...

O altă metodă constă în stratificarea probei pe suprafața soluției cu un gradient continuu de densitate care acoperă gama de densități a tuturor componentelor amestecului. Centrifugarea se efectuează până când densitatea plutitoare a particulelor este egală cu densitatea zonelor corespunzătoare, adică până când are loc separarea particulelor în zone. Metoda se numește centrifugare zonal-izopicnică sau rezonantă, deoarece punctul principal aici este densitatea plutitoare și nu dimensiunea sau forma particulelor. Densitatea la care particulele formează benzi izopicnice este influențată de natura mediului de suspensie; particulele pot fi permeabile pentru unii compuși în soluție și impermeabile pentru alții sau pot atașa molecule de soluție. Când se utilizează un rotor zonal, mitocondriile, lizozomii, peroxizomii și microsomii sunt concentrați în benzi cu 42%, 47%, 47% și 27% zaharoză, corespunzând densităților de 1,18, 1,21, 1,21 și 1,10 g-cm -3 respectiv. Densitatea organelor subcelulare depinde și de absorbția selectivă a anumitor compuși. Administrarea WR-1339, un detergent Triton WR-1339, care nu provoacă hemoliză, duce la o creștere a dimensiunii și la o scădere a densității lizozomilor hepatici; densitatea mitocondriilor și a peroxizomului rămâne neschimbată. În ciuda faptului că proprietățile de sedimentare ale lizozomilor, de regulă, nu se modifică, densitatea lor de echilibru în gradientul zaharoză scade de la 1,21 la 1,1, ceea ce duce la o separare corespunzătoare a fracției lizozomale-peroxizomale. Această caracteristică este utilizată în separarea cantitativă a lizozomilor, mitocondriilor și peroxizomilor, pe baza îndepărtării dintr-un mediu omogen a tuturor particulelor cu o densitate mai mare decât în microsomi și a centrifugării izopicnice ulterioare a particulelor grele precipitate.

2.4 Centrifugarea cu gradient de densitate de echilibru

Sărurile sunt folosite pentru a crea un gradient de densitate metale grele, de exemplu rubidiu sau cesiu, precum și soluții de zaharoză. O probă, cum ar fi ADN, este amestecată cu o soluție concentrată de clorură de cesiu. Atât solutul, cât și solventul sunt distribuite inițial uniform pe tot volumul. În cursul centrifugării, se stabilește o distribuție de echilibru a concentrației și, în consecință, densitatea CsCl, deoarece ionii de cesiu au o masă mare. Sub acțiunea accelerării centrifuge, moleculele de ADN sunt redistribuite, colectându-se sub forma unei zone separate în partea eprubetei cu densitatea corespunzătoare. Metoda este utilizată în principal în centrifugarea analitică și a fost utilizată de Meselson și Stahl pentru a studia mecanismul de replicare a ADN-ului de E. coli. Centrifugarea cu gradient de densitate de echilibru este, de asemenea, una dintre metodele de separare și studiere a lipoproteinelor plasmatice umane.

2.5 Conturarea și extragerea gradienților

2.5.1 Natura gradienților

Pentru a crea gradienți de densitate a soluțiilor, soluțiile de zaharoză sunt cel mai des utilizate, uneori cu un pH fix. În unele cazuri, o separare bună se obține folosind D2 0 în loc de apă obișnuită. 2.1 prezintă proprietățile unor soluții de zaharoză.

Alegerea gradientului este dictată de sarcinile specifice de fracționare. De exemplu, Ficoll de la Pharmacia Fine Chemicals poate înlocui zaharoza atunci când sunt necesari gradienți de densitate mare cu presiune osmotică scăzută. Un alt avantaj al ficoll este că nu trece prin membranele celulare. Pentru a crea gradienți de densitate mai mare, se folosesc săruri ale metalelor grele, cum ar fi rubidiu și cesiu, totuși, datorită efectului coroziv al CsCl, astfel de gradienți sunt utilizați numai în rotoarele din metale rezistente, precum titanul. "

2.5.2 Procedură pentru crearea unui gradient de densitate în trepte

Pentru a crea un gradient de densitate, mai multe soluții de densitate care scade succesiv sunt pipetate cu atenție într-un tub de centrifugă. Apoi, pe stratul superior, care are cea mai mică densitate, proba este stratificată sub forma unei zone înguste, după care tubul este centrifugat. Gradienții liniari netezi pot fi obținuți prin netezirea gradienților treptelor cu o soluție de lungă durată. Procesul poate fi accelerat prin agitarea ușoară a conținutului tubului cu un fir sau prin agitarea ușoară a tubului.

2.5.3 Metoda de creare gradient neted densitate

În majoritatea cazurilor, un dispozitiv special este utilizat pentru a crea un gradient de densitate neted. Se compune din două vase cilindrice cu diametru egal strict definit, care comunică între ele în partea de jos folosind un tub de sticlă cu o supapă de control, care vă permite să reglați proporțiile în care este amestecat conținutul ambelor vase. Una dintre ele este echipată cu un agitator și are o ieșire prin care soluția curge în tuburi de centrifugă. Soluția mai densă este plasată într-un mixer; al doilea cilindru este umplut cu o soluție de densitate mai mică. Înălțimea coloanei de soluții din ambii cilindri este setată astfel încât presiunea hidrostatică din aceștia să fie aceeași. Soluția mai densă este descărcată treptat din mixer în tuburile centrifugei și este înlocuită simultan cu un volum egal de soluție cu densitate mai mică care intră în mixer din cel de-al doilea cilindru prin supapa de reținere. Omogenitatea soluției în mixer este asigurată prin amestecarea constantă a soluției cu un mixer. Pe măsură ce soluția este turnată în tuburi de centrifugă, densitatea acesteia scade și se creează un gradient de densitate liniar în tuburi. Gradienții neliniari pot fi creați folosind un sistem format din doi cilindri de diametru inegal.

Pentru a forma gradienți de densitate de abrupt diferit, se utilizează un sistem de două seringi controlate mecanic, care sunt umplute cu soluții de densitate inegală. Pot fi creați diferiți gradienți prin variația vitezei relative a pistoanelor.

2.5.4 Extragerea gradienților din tuburile de centrifugă

După finalizarea centrifugării și separarea particulelor, este necesar să se îndepărteze zonele formate. Acest lucru se face în mai multe moduri, cel mai adesea prin deplasare. Un tub de centrifugă este străpuns la bază și un mediu foarte dens, de exemplu, 60-70% soluție de zaharoză, este introdus încet în partea sa inferioară. Soluția de deasupra este deplasată și fracțiile sunt retrase folosind o seringă, o pipetă sau un dispozitiv special conectat printr-un tub la un colector de fracțiuni. Dacă tuburile sunt realizate din celuloid sau nitroceluloză, fracțiile sunt extrase prin tăierea tubului cu o lamă specială. Pentru a face acest lucru, un tub de centrifugă, fixat într-un raft, este tăiat direct sub zona dorită și fracția este aspirată cu o seringă sau pipetă. Cu un design adecvat al tăietorului, pierderea mortarului va fi minimă. Colectarea fracțiilor se realizează și prin puncția bazei eprubetei cu un ac subțire gol. Picăturile care curg din tub prin ac sunt colectate într-un colector de fracții pentru o analiză ulterioară.

2.5.5 Centrifugele preparative și aplicațiile acestora

Centrifugele preparative pot fi clasificate în trei grupe principale: centrifugele de uz general, centrifugele de mare viteză și ultracentrifugele pregătitoare. Centrifugele de uz general oferă o viteză maximă de 6.000 rpm și o OCU de până la 6.000 g. Acestea diferă între ele doar prin capacitate și au un număr de rotoare înlocuibile: unghiulare și cu ochelari suspendați. Una dintre caracteristicile acestui tip de centrifuge este capacitatea lor mare - de la 4 la 6 dm3, care le permite să fie încărcate nu numai cu tuburi de centrifugă de 10,50 și 100 cm3, ci și cu vase cu o capacitate de până la 1,25 dm3. La toate centrifugele de acest tip, rotoarele sunt atașate rigid la arborele de antrenare, iar tuburile centrifugii, împreună cu conținutul lor, trebuie să fie echilibrate cu atenție și să difere în greutate cu cel mult 0,25 g. Nu puteți încărca un număr impar de tuburi în rotor și, dacă rotorul nu este complet încărcat, tuburile trebuie plasate simetric, unul împotriva celuilalt, asigurând astfel distribuția uniformă a tuburilor în jurul axei de rotație a rotorului.

Centrifugele de mare viteză oferă o viteză maximă de 25.000 rpm-1 și un OCU de până la 89.000 g. Camera rotorului este echipată cu un sistem de răcire care previne încălzirea cauzată de frecare în timpul rotației rotorului. De regulă, centrifugele de mare viteză au o capacitate de 1,5 dm3 și sunt echipate cu rotoare înlocuibile, atât cu unghiuri cât și cu boluri suspendate.

Ultracentrifugele preparative asigură o viteză maximă de până la 75.000 rpm și o accelerație centrifugă maximă de 510.000 g. Acestea sunt echipate atât cu un frigider, cât și cu o unitate de vid pentru a preveni supraîncălzirea rotorului din cauza fricțiunii împotriva aerului. Rotoarele unor astfel de centrifuge sunt fabricate din aliaje de aluminiu sau titan de înaltă rezistență. Rotoarele din aliaje de aluminiu sunt utilizate în principal, cu toate acestea, în cazurile în care sunt necesare viteze deosebit de mari, sunt utilizate rotoare din titan. Pentru a reduce vibrațiile rezultate din dezechilibrul rotorului datorită umplerii neuniforme a tuburilor de centrifugă, ultracentrifugele au un arbore flexibil. Tuburile de centrifugă și conținutul acestora trebuie echilibrate cu atenție până la cel mai apropiat de 0,1 g. Cerințe similare trebuie respectate la încărcarea rotoarelor de centrifugă de uz general.

2.6 Proiectarea rotoarelor

2.6.1 Rotoare unghiulare și rotoare cu boluri suspendate

Rotoarele pentru centrifugele pregătitoare sunt de obicei de două tipuri - pahare unghiulare și suspendate. Acestea sunt numite unghiulare, deoarece tuburile de centrifugă plasate în ele sunt tot timpul la un anumit unghi față de axa de rotație. La rotoarele cu pahare suspendate, eprubetele sunt instalate vertical, iar la rotire, sub acțiunea forței centrifuge care se ridică, se deplasează într-o poziție orizontală; unghiul de înclinare față de axa de rotație este de 90 °.

La rotoarele unghiulare, distanța parcursă de particule până la peretele corespunzător al tubului este foarte mică și, prin urmare, sedimentarea are loc relativ rapid. După ciocnirea cu pereții tubului, particulele alunecă în jos și formează un sediment în partea de jos. În timpul centrifugării, apar fluxuri de convecție, care complică foarte mult separarea particulelor cu proprietăți de sedimentare similare. Cu toate acestea, rotoarele de acest design sunt utilizate cu succes pentru separarea particulelor, ale căror rate de sedimentare diferă destul de semnificativ.

Fenomenele de convecție sunt observate și la rotoarele cu cupe suspendate, dar nu sunt atât de pronunțate. Convecția este rezultatul faptului că, sub acțiunea de accelerație centrifugă, particulele se așează într-o direcție care nu este strict perpendiculară pe axa de rotație și, prin urmare, la fel ca în rotoarele unghiulare, lovesc pereții eprubetei și glisează în partea de jos .

Efectele de convecție și turbulență pot fi evitate într-o oarecare măsură prin utilizarea tuburilor sectoriale în rotoare cu boluri suspendate și prin ajustarea vitezei rotorului; cele de mai sus, dezavantajele sunt, de asemenea, lipsite de metoda de centrifugare într-un gradient de densitate.

2.6.2 Rotoare continue

Rotoarele continue sunt proiectate pentru fracționarea de mare viteză a unor cantități relativ mici de material solid din suspensii de volume mari, de exemplu, pentru izolarea celulelor din mediile de cultură. În timpul centrifugării, suspensia de particule este adăugată continuu la rotor; debitul rotorului depinde de natura preparatului precipitat și variază de la 100 cm3 la 1 dm3 pe minut. Particularitatea rotorului este că este o cameră izolată cu un design special; conținutul său nu comunică cu mediul extern și, prin urmare, nu este contaminat sau pulverizat.

2.6.3 Rotoare de zonă sau rotoare Anderson

Rotoarele zonale sunt fabricate din aliaje de aluminiu sau titan care pot rezista la accelerații centrifuge foarte semnificative. De obicei au o cavitate cilindrică care este închisă de un capac detașabil. În interiorul cavității, pe axa de rotație, există un tub axial, pe care este pusă o duză cu lame, împărțind cavitatea rotorului în patru sectoare. Lamele sau deflectoarele au canale radiale prin care se injectează un gradient din tubul axial către periferia rotorului. Cu acest design al lamei, convecția este redusă la minimum.

Rotorul este umplut când se rotește cu o viteză de aproximativ 3000 rpm-1. Un gradient creat anterior este injectat în rotor, pornind de la stratul cu cea mai mică densitate, care este distribuit uniform de-a lungul periferiei rotorului și este ținut de peretele său exterior perpendicular pe axa de rotație datorită forței centrifuge. Adăugarea ulterioară a straturilor cu gradient de densitate mai mare se deplasează continuu spre centrul straturilor mai puțin dense. După ce întregul gradient a fost pompat în rotor, acesta este umplut până la volumul său maxim cu o soluție numită „pernă”, a cărei densitate este aceeași sau depășește ușor cea mai mare densitate a gradientului preformat.

Apoi, prin tubul axial, eșantionul de testare este stratificat, care este deplasat din tub în volumul rotorului utilizând o soluție de densitate mai mică, în timp ce același volum al „pernei” este îndepărtat de la periferie. După toate aceste proceduri, viteza rotorului este adusă la viteza de lucru și, pentru perioada de timp necesară, se efectuează fie fracționarea cu viteză zonală, fie fracționarea zonală-izopicnică. Extracția fracțiilor se efectuează la o viteză a rotorului de 3000 rpm - min-1. Conținutul rotorului este deplasat prin adăugarea unei „perne” de la periferie, în primul rând straturile mai puțin dense sunt deplasate. Datorită designului special al canalului axial al rotorului Anderson, nu există amestecarea zonelor atunci când acestea sunt deplasate. Gradientul de ieșire este trecut printr-un dispozitiv de înregistrare, de exemplu, o celulă de spectrofotometru, cu ajutorul căreia conținutul de proteine poate fi determinat prin absorbție la 280 nm sau printr-un detector special de radioactivitate, după care se colectează fracțiile.

Capacitatea rotoarelor zonale utilizate la viteze medii variază de la 650 la 1600 cm3, ceea ce permite obținerea unei cantități destul de mari de material. Rotoarele de zonă sunt utilizate pentru a elimina contaminanții proteici din diferite preparate și pentru a izola și purifica mitocondriile, lizozomii, polizomii și proteinele.

2.6.4 Analiza fracțiilor subcelulare

Proprietățile particulelor subcelulare obținute prin fracționarea preparatului pot fi atribuite proprietăților particulelor în sine numai dacă preparatul nu conține impurități. Prin urmare, este întotdeauna necesar să se evalueze puritatea preparatelor primite. Eficiența omogenizării și prezența impurităților în preparat pot fi determinate prin examinare microscopică. Cu toate acestea, absența impurităților vizibile nu este încă o dovadă fiabilă a purității preparatului. Pentru a cuantifica puritatea, se supune preparatului rezultat analiza chimica, care vă permite să stabiliți conținutul de proteine sau ADN din acesta, să îl determinați activitate enzimatică, dacă este posibil, și proprietăți imunologice.

Analiza distribuției enzimelor în țesuturile fracționate se bazează pe două principii generale... Primul este că toate particulele dintr-o anumită populație subcelulară conțin același set de enzime. Al doilea presupune că fiecare enzimă este localizată într-un anumit loc din celulă. Dacă această poziție ar fi adevărată, atunci enzimele ar putea acționa ca markeri pentru organitele corespunzătoare: de exemplu, citocrom oxidaza și monoaminooxidaza ar servi ca markeri mitocondriale, hidrolazele acide ca markeri ai lizozomilor, catalaza ca markeri ai peroxizomilor și glucoza-6- fosfataza - un marker al membranelor microsomice. Cu toate acestea, sa dovedit că unele enzime, de exemplu malat dehidrogenază, P-glucuronidază, NADPH-citocrom-c-reductază, sunt localizate în mai mult de o fracțiune. abordată cu mare atenție. Mai mult, absența unei enzime marker nu înseamnă absența organelor corespunzătoare. Este probabil ca, în timpul fracționării, enzima să fie pierdută de organite sau să fie inhibată sau inactivată; prin urmare, pentru fiecare fracție, la cel puțin două enzime marker sunt de obicei determinate.

Fracțiune	Volum, cm "	Ameliorare generală	Acțiune, 660 nm	Unități de activitate enzimatică	Randamentul activității în fracție,%
121	1:35	0,45	515
30	1:21,7	0,195	35,2	6,99
21,5	1:105	0,3	186,3	37
16,5	1:105	0,34	162	32,17
21	1:27,7	0,41	51,5	10,23
287	1:21,7	0,04	68,5	13,61
503,5	100

2.7 Fracționarea prin centrifugare diferențială

2.7.1 Exprimarea rezultatelor

Rezultatele obținute prin fracționarea țesutului sunt prezentate cel mai convenabil sub formă de grafice. Deci, atunci când se studiază distribuția enzimelor în țesuturi, datele sunt prezentate cel mai bine sub formă de histograme, care fac posibilă evaluarea vizuală a rezultatelor experimentelor.

Activitate enzimatică, conținutul de proteine din probă este determinat atât în omogenatul original, cât și în fiecare fracție subcelulară izolată separat. Activitatea enzimatică totală și conținutul de proteine din fracțiuni nu ar trebui să difere mult de valorile corespunzătoare din omogenatul original.

Apoi, activitatea enzimatică și conținutul de proteine din fiecare fracție sunt calculate în% din randamentul total, pe baza căruia se face o histogramă. Abscisa arată cantitatea relativă de proteine din fiecare fracție în ordinea izolării lor, iar ordonata arată activitatea specifică relativă a fiecărei fracții. Astfel, activitatea enzimatică a fiecărei fracții este determinată de aria coloanelor.

2.7.2 Ultracentrifugare analitică

Spre deosebire de centrifugarea preparativă, al cărei scop este separarea substanțelor și purificarea acestora, ultracentrifugarea analitică este utilizată în principal pentru a studia proprietățile de sedimentare ale macromoleculelor biologice și ale altor structuri. Prin urmare, în centrifugarea analitică, se utilizează rotoare și sisteme de înregistrare cu un design special: acestea vă permit să monitorizați continuu sedimentarea materialului în câmpul centrifugal.

Ultracentrifugele analitice pot atinge viteze de până la 70.000 rpm, generând în același timp accelerații centrifuge de până la 500.000 g. Rotorul lor, de regulă, are forma unui elipsoid și este conectat printr-un șir la un motor, ceea ce vă permite să variați viteza de rotație a rotorului. Rotorul se rotește într-o cameră de vid dotată cu un dispozitiv de refrigerare și are două celule, una analitică și una de echilibrare, care sunt instalate în centrifugă strict vertical, paralel cu axa de rotație. Celula de echilibrare este utilizată pentru echilibrarea celulei analitice și este un bloc metalic cu un sistem de precizie. De asemenea, conține două găuri index situate la o distanță strict definită de axa de rotație, cu ajutorul cărora sunt determinate distanțele corespunzătoare în celula analitică. Celula analitică, a cărei capacitate este de obicei de 1 cm3, are o formă sectorială. Când este instalat corect în rotor, deși stă în poziție verticală, funcționează pe același principiu ca un rotor cu boluri suspendate, creând condiții de sedimentare aproape ideale. La capetele celulei analitice există ferestre cu sticlă de cuarț. Ultracentrifugele analitice sunt echipate cu sisteme optice care permit observarea sedimentării particulelor pe parcursul întregii perioade de centrifugare. La intervale prestabilite, materialul sedimentar poate fi fotografiat. La fracționarea proteinelor și a ADN-ului, sedimentarea este monitorizată prin absorbție în lumina ultravioletă și în cazurile în care soluțiile studiate au indici de refracție diferiți, utilizând un sistem schlieren sau sistemul de interferență al lui Rayleigh. Ultimele două metode se bazează pe faptul că atunci când lumina trece printr-o soluție transparentă formată din zone cu densități diferite, refracția luminii are loc la marginea zonelor. În timpul sedimentării, se formează o graniță între zonele cu particule grele și ușoare, care acționează ca o lentilă de refracție; în acest caz, un vârf apare pe placa fotografică utilizată ca detector. În timpul sedimentării, granița se mișcă și, în consecință, vârful, după viteza de mișcare a cărei viteză de sedimentare a materialului poate fi judecată. Sistemele interferometrice sunt mai sensibile decât sistemele schlieren. Celulele analitice sunt un sector, care sunt utilizate cel mai des, și două sector, care sunt utilizate pentru studiul comparativ al solventului și al substanței dizolvate.

În biologie, ultracentrifugarea analitică este utilizată pentru a determina greutățile moleculare ale macromoleculelor, pentru a verifica puritatea probelor obținute și, de asemenea, pentru a studia modificările conformaționale ale macromoleculelor.

2.8 Aplicații ale ultracentrifugării analitice

2.8.1 Determinarea greutăților moleculare

Există trei metode principale pentru determinarea greutăților moleculare utilizând ultracentrifugarea analitică: determinarea vitezei de sedimentare, metoda echilibrului de sedimentare și metoda de aproximare a echilibrului de sedimentare.

Determinarea greutății moleculare prin viteza de sedimentare este cea mai comună metodă. Centrifugarea se efectuează la viteze mari, astfel încât particulele, distribuite inițial uniform pe tot volumul, încep să se miște pentru a se deplasa de-a lungul razei de la centrul de rotație. Se formează o interfață clară între regiunea solventului, care este deja lipsită de particule, și partea care le conține. Această limită se mișcă în timpul centrifugării, ceea ce face posibilă determinarea vitezei de sedimentare a particulelor folosind una dintre metodele menționate mai sus, înregistrând această mișcare pe o placă fotografică.

Viteza de sedimentare este determinată de următorul raport:

unde x este distanța de la axa de rotație în cm,

t-timp în s,

w - viteza unghiulară în rad-s-1,

s este coeficientul de sedimentare al „moleculei.

Coeficientul de sedimentare este viteza pe unitate de accelerație și se măsoară în unități Seedberg; 1 unitate de Swedberg este egală cu 10_13 s. Valoarea numerică a lui s depinde de greutatea moleculară și forma particulelor și este o cantitate caracteristică unei molecule date sau a unei structuri supramoleculare. De exemplu, coeficientul de sedimentare al lizozimei este de 2,15 S; catalaza are un coeficient de sedimentare de 11.35S, subunitățile ribozomului bacterian - de la 30 la 50S și subunitățile ribozomului eucariot - de la 40 la 60S.

unde M este greutatea moleculară a moleculei, R este constanta gazului, T este temperatura absolută, s este coeficientul de sedimentare al moleculei, D este coeficientul de difuzie al moleculei, v este volumul specific parțial, care poate fi considerat ca volumul ocupat de un gram de dizolvat, p este densitatea solventului.

Metoda echilibrului de sedimentare. Determinarea greutăților moleculare prin această metodă se efectuează la viteze relativ mici ale rotorului, de ordinul 7.000-8.000 rpm-1, astfel încât moleculele cu o greutate moleculară ridicată să nu se așeze pe fund. Ultracentrifugarea se efectuează până când particulele ajung la echilibru, care se stabilește sub acțiunea forțelor centrifuge, pe de o parte, și a forțelor de difuzie, pe de altă parte, adică până când particulele încetează să se miște. Apoi, gradientul de concentrație rezultat este utilizat pentru a calcula greutatea moleculară a substanței "conform formulei

unde R este constanta gazului, T este temperatura absolută, ω este viteza unghiulară, p este densitatea solventului, v este volumul specific parțial, cx și c2 sunt concentrația solutului la distanțele r și r2 de la axa de rotație.

Dezavantajul acestei metode este că este nevoie de mult timp pentru a obține echilibrul de sedimentare - de la câteva zile la câteva săptămâni cu funcționarea continuă a centrifugei.

Metoda de abordare a echilibrului de sedimentare a fost dezvoltată pentru a depăși dezavantajele metodei anterioare asociate cu timpul necesar „stabilirii echilibrului. Cu această metodă, este posibil să se determine greutățile moleculare atunci când soluția centrifugată este într-o stare de aproape În primul rând, macromoleculele sunt distribuite. uniform pe întregul volum al celulei analitice; apoi, pe măsură ce centrifugarea continuă, moleculele se stabilesc și densitatea soluției din zona meniscului scade treptat. Modificarea densității este înregistrată cu atenție și apoi, folosind calcule complexe care implică un număr mare de variabile, greutatea moleculară a acestui compus este determinată de formule:

unde R este constanta gazului, T este temperatura absolută, v este volumul specific parțial, p este densitatea solventului, dcldr este gradientul de concentrație al macromoleculei, hm și gd sunt distanța până la menisc și fundul eprubeta, respectiv, cm și sd sunt concentrația de macromolecule la menisc și y fundul eprubetei, respectiv, Mm și MR sunt valorile greutăților moleculare determinate de distribuția concentrației substanței la nivelul menisc și, respectiv, partea inferioară a tubului.

2.8.2 Evaluarea purității medicamentelor

Ultracentrifugarea analitică este utilizată pe scară largă pentru a evalua puritatea preparatelor ADN, virus și proteine. Puritatea medicamentelor este, fără îndoială, foarte importantă în cazurile în care este necesar să se determine cu exactitate greutatea moleculară a unei molecule. În majoritatea cazurilor, omogenitatea unui preparat poate fi judecată după natura limitei de sedimentare utilizând metoda de determinare a vitezei de sedimentare: un preparat omogen oferă de obicei o limită definită brusc. Impuritățile prezente în preparat apar ca un vârf sau umăr suplimentar; ele determină, de asemenea, asimetria vârfului principal.

2.8.3 Studiul modificărilor conformaționale în macromolecule

Un alt domeniu de aplicare a ultracentrifugării analitice este studiul modificărilor conformaționale în macromolecule. Molecula de ADN, de exemplu, poate fi monocatenară sau dublă, liniară sau circulară. Sub influența diferiților compuși sau la temperaturi ridicate, ADN-ul suferă o serie de modificări conformaționale reversibile și ireversibile, care pot fi stabilite printr-o modificare a vitezei de sedimentare a probei. Cu cât este mai compactă molecula, cu atât este mai mic coeficientul de frecare în soluție și invers: cu cât este mai puțin compact, cu atât este mai mare coeficientul de frecare și, prin urmare, cu atât mai lent va sedimenta. Astfel, diferențele de viteză de sedimentare a eșantionului înainte și după diferite impacturi asupra acestuia fac posibilă detectarea modificărilor conformaționale care apar în macromolecule.

În proteinele alosterice, cum ar fi, de exemplu, aspartatul transcarbamoilază, apar modificări conformaționale ca urmare a legării lor la substrat și liganzi mici. Disocierea proteinei în subunități poate fi cauzată prin tratarea acesteia cu substanțe precum ureea sau paracloromercuribenzoatul. Toate aceste modificări pot fi urmărite cu ușurință folosind ultracentrifugarea analitică.

Prelegerea numărul 5

Separarea amestecurilor neomogene lichide se realizează efectiv prin metoda centrifugării bazată pe utilizarea forței centrifuge. Aparatele în care amestecurile lichide neomogene sunt separate prin forță centrifugă se numesc centrifuge.

Metoda de centrifugare este utilizată pe scară largă în diverse domenii ale tehnologiei; numărul de tipuri și modele de centrifuge este foarte mare.

Partea principală a centrifugei este un tambur (rotor cu pereți solizi sau perforați) care se rotește cu viteză mare pe un arbore vertical sau orizontal. Separarea amestecurilor neomogene în centrifuge poate fi efectuată fie pe principiul decantării, fie pe principiul filtrării. În primul caz, se folosesc tamburi cu pereți solizi, în al doilea - cu găuri; tamburile cu găuri sunt acoperite cu un filtru. Dacă pereții tamburului sunt solizi, atunci materialul sub acțiunea forței centrifuge este dispus în straturi în funcție de greutatea specifică, iar un strat de material cu o greutate specifică mare este situat direct la pereții tamburului. Dacă pereții tamburului au găuri și sunt echipate pe suprafața interioară cu o partiție filtrantă, de exemplu, o cârpă filtrantă, atunci particulele solide ale amestecului rămân pe partiția filtrantă, iar faza lichidă trece prin porii solidului despărțitor de sedimente și filtrare și este îndepărtat din tambur. Se numește faza lichidă separată într-o centrifugă fugat.

Forța centrifugă; factor de separare. Odată cu rotația tamburului de centrifugă și a lichidului din acesta, forța centrifugă apare ca o forță de inerție.

С = m W 2 / r (1)

m- greutatea corpului rotativ (fluid) în kgf;

r este raza de rotație în m

W este viteza de rotație circumferențială în Domnișoară;

Viteza de rotație periferică este definită ca:

W = ω r = 2 π n r / 60 (2)

NS- numărul de rotații pe minut;

ω -viteza unghiulară de rotație în radiani

g-accelerația gravitației în m / s 2 dacă m = G / g, atunci forța centrifugă CU, acționând asupra unui corp rotativ cu masa m și greutate G, este egal cu C = G (2π n r / 60) 2 / rg Sau C ≈ G n 2 r / 900 (3)

Ecuația (2.3) arată că o creștere a forței centrifuge se realizează mai ușor prin creșterea numărului de rotații decât prin creșterea diametrului tamburului. Tobe de diametru mic, dar cu un numar mare rotațiile pot dezvolta mai multă forță centrifugă decât tamburele cu diametru mare, dar la un număr redus de rotații.

Astfel, forța centrifugă care acționează asupra unei particule poate fi mai mare decât forța gravitațională de câte ori accelerația forței centrifuge este mai mare decât accelerația cădere liberă... Raportul acestor accelerații se numește factor de separare și desemnați Кр:

W 2 / r - accelerarea forței centrifuge.

Luând G = 1н, obținem: Кр = n 2 r / 900

De exemplu, pentru o centrifugă cu un rotor cu un diametru de 1000 mm (r = 0,5 m) care se rotește cu o viteză de n = 1200 rpm, factorul de separare va fi 800. Acțiunea de separare a centrifugei crește proporțional cu valoarea din Кр.

Valoarea K pentru cicloni este de ordinul sutelor. Și pentru centrifuge - aproximativ 3000, astfel forta motrice procesul de sedimentare în cicloni și centrifugi este cu 2-3 ordine de mărime mai mare decât în rezervoarele de sedimentare. Ca urmare, productivitatea ciclonilor și a centrifugelor este mai mare decât capacitatea rezervoarelor de sedimentare și se pot separa eficient Particule fine: în centrifuge de aproximativ 1 micron. La cicloni - aproximativ 10 microni.

Dintr-o comparație a ecuațiilor, se poate observa că factorul de separare K p este numeric egal cu forța centrifugă care se dezvoltă în timpul rotației unui corp cu o greutate de 1 kg.

Caracterizarea proceselor de centrifugare ... După cum s-a menționat mai sus, centrifugarea poate fi efectuată pe principiul decantării (în tamburi solizi) sau pe principiul filtrării (în tamburi perforate). În esența lor fizică, ambele procese diferă unele de altele. În plus, există soiuri separate ale fiecăruia dintre aceste procese, care sunt determinate de conținutul fazei solide și de gradul de dispersie a acesteia, precum și de proprietățile fizice ale suspensiei.

Centrifugarea în tamburi de decantare se realizează atât pentru curățarea lichidelor de contaminanți conținuți în cantități mici (clarificarea lichidelor), cât și pentru separarea suspensiilor care conțin o cantitate semnificativă de fază solidă (centrifugare de decantare).

Centrifugarea în tamburi de decantare constă în general din două procese fizice: sedimentarea fazei solide (procesul se desfășoară conform legilor hidrodinamicii) și compactarea nămolului; ultimul proces este supus legilor de bază ale mecanicii solului (medii dispersate).

Până la o anumită limită a concentrației fazei solide (aproximativ egală cu 3-4% în volum), sedimentarea sa în tamburul de decantare se desfășoară fără formarea unei interfețe între solid și lichid. Cu o creștere a concentrației, o astfel de suprafață se formează datorită măririi și depunerii particulelor solide în lichid.

Procesul de centrifugare în tamburi de decantare este fundamental diferit de procesul de separare din rezervoarele de decantare. În acesta din urmă, rata de sedimentare poate fi practic considerată constantă, deoarece procesul are loc într-un câmp gravitațional, a cărui accelerare nu depinde de coordonatele particulei incidente.

Accelerarea câmpului forțelor centrifuge este o valoare variabilă și depinde, la viteză unghiulară constantă, de raza de rotație a particulei. În plus, liniile de forță ale câmpului centrifugal nu sunt paralele între ele și, prin urmare, direcția de acțiune a forțelor centrifuge va fi diferită pentru diferite particule(care nu se află pe aceeași rază de rotație).

Prin urmare, modelele proceselor de decantare nu pot fi extinse la procesul de centrifugare în tobe de decantare.

Capacitatea de separare a centrifugelor de decantare este caracterizată de indicele de productivitate (sigma) Σ, care este produsul zonei suprafeței cilindrice de depunere F din rotor și factorul de separare Kp.

Σ = F Кр (1), Кр = W2 / rg ≈n2 r / 900, de unde Σ / F = Кр (2)

Ținând cont de faptul că factorul de separare exprimă raportul vitezei de decantare a particulelor din centrifuga de decantare și din rezervorul de decantare, în conformitate cu egalitatea (2), valoarea lui Σ trebuie considerată egală cu aria rezervorului de decantare. , echivalent în performanță pentru o suspensie dată centrifugii în cauză. Indicele de performanță reflectă impactul tuturor caracteristici de proiectare centrifugă de sedimentare, determinând capacitatea sa de separare.

La determinarea performanței centrifugelor de decantare de tip lot, este necesar să se țină seama de timpul petrecut la pornirea, frânarea și descărcarea centrifugii. Determinarea performanței unei centrifuge cu filtru este la fel de dificilă ca determinarea performanței oricărui filtru.

Chiar mai complex este procesul de centrifugare în tamburi de filtrare... Procesul se desfășoară în trei etape:

formarea sedimentelor, compactarea sedimentelor și, în cele din urmă, îndepărtarea lichidului reținut de forțele capilare și moleculare din porii sedimentului.

Ca urmare, întregul proces de filtrare centrifugă nu poate fi identificat cu filtrarea convențională din cauza gravitației. Doar prima sa perioadă este aproape apropiată de filtrarea convențională și diferă de aceasta numai prin magnitudinea capului hidraulic al lichidului care curge prin stratul de sedimente sub acțiunea forțelor centrifuge. În această perioadă, umiditatea din sediment este în formă liberă și este îndepărtată din acesta cel mai intens. A doua perioadă este similară perioadei corespunzătoare din timpul centrifugării de decantare și, în cele din urmă, a treia se caracterizează prin pătrunderea aerului în nămolul compactat, adică uscarea mecanică a nămolului.

Durata perioadelor de mai sus depinde de proprietăți fiziceși concentrația suspensiilor, precum și caracteristicile centrifugei.

Complexitatea și diversitatea proceselor de centrifugare face dificilă dezvoltarea unei teorii a procesului (în special a cineticii sale) și a unor metode exacte pentru calcularea centrifugelor.

Performanță centrifugă... De obicei, productivitatea centrifugelor este exprimată prin volumul de suspensie care intră în centrifugă pe unitate de timp (l / oră), sau greutatea sedimentului rezultată în urma centrifugării (kg / oră).

Metoda centrifugării se bazează pe comportamentul diferit al particulelor din câmpul centrifugal creat de centrifugă. Proba din vasul de centrifugare este plasată într-un rotor acționat de un mecanism de centrifugare. Pentru a separa un amestec de particule, trebuie selectat un set de condiții, cum ar fi viteza de rotație, timpul de centrifugare și raza rotorului. Pentru particulele sferice, viteza de sedimentare (sedimentare) depinde nu numai de accelerație, ci și de raza și densitatea particulelor, precum și de vâscozitatea mediului în care este depusă proba.

Centrifugarea poate fi împărțită în două tipuri: preparativă și analitică. Centrifugarea preparativă este utilizată atunci când este necesară izolarea unei părți a probei pentru cercetări ulterioare. Această metodă este utilizată pentru a izola celulele de suspensie, macromolecule biologice etc.

Centrifugarea analitică este utilizată pentru a studia comportamentul macromoleculelor biologice într-un câmp centrifugal. Această metodă permite obținerea de date despre masa, forma și dimensiunea moleculelor în volume de probă relativ mici. În practica de laborator de zi cu zi, centrifugarea pregătitoare este cea mai obișnuită practică.

La rândul lor, centrifugele de laborator pregătitoare sunt împărțite în grupuri în funcție de scop: ultracentrifuge preparative, centrifuge de uz general și centrifuge de mare viteză. Centrifugele de uz general sunt cele mai mari uz practicîn laboratoarele medicale, au o viteză maximă de până la 6 mii rpm. Principala caracteristică a acestui tip de dispozitive este capacitatea lor relativ mare - până la 6 litri, ceea ce face posibilă utilizarea pentru centrifugare nu numai a tuburilor de centrifugă cu un volum de până la 100 ml, ci și a capacităților de până la 1,25 litri. În toate centrifugele de uz general, rotoarele sunt montate rigid pe arborele de acționare, astfel încât containerul centrifugat trebuie să fie echilibrat destul de precis. Pentru a evita ruperea, nu încărcați un număr impar de tuburi în rotor; în caz de încărcare incompletă, containerul trebuie plasat unul față de celălalt.

Centrifugele de mare viteză au o viteză maximă de 25 mii rpm și o accelerație de până la 89 mii g. Camera care conține rotorul și probele centrifugate este echipată cu un sistem de răcire pentru a preveni căldura generată de frecare atunci când rotorul se rotește la viteze mari. În mod obișnuit, aceste centrifuge pot rezolva volume de până la 1,5 litri și sunt echipate cu rotoare cu unghi sau înlocuibile.

Ultracentrifugele preparative accelerează la 75.000 rpm și au o accelerație centrifugă maximă de 510 mii g. Acestea sunt echipate cu unități de refrigerare și vid pentru a preveni supraîncălzirea rotorului de frecare împotriva aerului. Rotoarele pentru aceste centrifuge sunt fabricate din aliaje de titan sau aluminiu de înaltă rezistență. Arborele ultracentrifugelor, spre deosebire de cele de mare viteză și cele pregătitoare, este flexibil pentru a reduce vibrațiile în caz de dezechilibru în rotor. Recipientele din rotor trebuie echilibrate cu grijă până la cea mai apropiată zecime de gram.

Munca cursului

Centrifugarea

1. Principiul metodei

iar accelerația centrifugă va fi apoi egală)

Deoarece o revoluție a rotorului este 2p radiani, viteza unghiulară a rotorului în rotații pe minut poate fi scrisă după cum urmează:

Accelerația centrifugă este de obicei exprimată în unități g și a sunat accelerare centrifugă relativă, adică

Când enumerați condițiile de separare a particulelor, indicați viteza de rotație și raza rotorului, precum și timpul de centrifugare. Accelerația centrifugă este de obicei exprimată în unități g, calculată din raza medie de rotație a coloanei de lichid într-un tub de centrifugă. Pe baza ecuației, Dole și Kotzias au compilat o nomogramă care exprimă dependența OCP de viteza și raza rotorului r.

unde t - timpul de sedimentare în secunde, rj - vâscozitate medie, g h - raza particulelor, r h - densitatea particulelor, p este densitatea mediului, g m este distanța de la axa de rotație la meniscul lichidului, g d este distanța de la axa de rotație la fundul eprubetei.

După cum urmează din ecuație, la o viteză dată a rotorului, timpul necesar depunerii particulelor sferice omogene este invers proporțional cu pătratul razelor lor și diferența dintre densitățile particulelor și mediul și este direct proporțională cu vâscozitatea a mediului. Prin urmare, un amestec de particule eterogene, aproximativ sferice, care diferă în densitate și dimensiune, poate fi separat fie datorită timpului lor de decantare diferit pe fundul tubului la o anumită accelerație, fie datorită distribuției particulelor de sedimentare de-a lungul tubului, care se stabilește după o anumită perioadă de timp. La separarea substanțelor, este necesar să se ia în considerare factori atât de importanți precum densitatea și vâscozitatea mediului. Metodele descrise pot separa organitele celulare de omogenatele tisulare. Componentele principale ale unei celule sunt depuse în următoarea secvență: mai întâi, celule întregi și fragmentele lor, apoi nuclei, cloroplaste, mitocondrii, lizozomi, microsomi și, în final, ribozomi. Depunerea particulelor non-sferice nu respectă ecuația, prin urmare, particulele de aceeași masă, dar de forme diferite, sunt depuse la viteze diferite. Această caracteristică este utilizată în studii care utilizează ultracentrifugarea conformației macromoleculelor.

constă în izolarea materialului biologic pentru studii biochimice ulterioare. În acest caz, este posibil să se ia cantități mari de material biologic inițial, de exemplu, inoculări de celule microbiene din culturi discontinue sau continue, precum și inoculări de celule vegetale și animale din țesuturi și plasmoculturi. Cu ajutorul centrifugării pregătitoare, un număr mare de particule celulare sunt izolate pentru a le studia morfologia, structura și activitatea biologică. Metoda este, de asemenea, utilizată pentru a izola macromoleculele biologice, cum ar fi ADN-ul și proteinele din preparatele pre-purificate.

Centrifugarea analitică este utilizat în principal pentru a studia preparatele pure sau practic pure de macromolecule sau particule, cum ar fi ribozomii. În acest caz, se utilizează o cantitate mică de material, iar sedimentarea particulelor investigate este înregistrată continuu utilizând sisteme optice speciale. Metoda permite obținerea de date privind puritatea, greutatea moleculară și structura materialului. În atelierele pentru studenți, centrifugarea pregătitoare este utilizată mult mai des decât centrifugarea analitică, așa că ne vom opri asupra ei mai detaliat, deși ambele metode se bazează pe principii generale.

2. Centrifugare preparativă

2.1 Centrifugarea diferențială

2.2 Centrifugarea zonei de viteză

2.3 Centrifugare izopicnică

O altă metodă constă în stratificarea probei pe suprafața soluției cu un gradient continuu de densitate care acoperă gama de densități a tuturor componentelor amestecului. Centrifugarea se efectuează până când densitatea plutitoare a particulelor este egală cu densitatea zonelor corespunzătoare, adică până când are loc separarea particulelor în zone. Metoda se numește centrifugare zonal-izopicnică sau rezonantă, deoarece punctul principal aici este densitatea plutitoare și nu dimensiunea sau forma particulelor. Densitatea la care particulele formează benzi izopicnice este influențată de natura mediului de suspensie; particulele pot fi permeabile pentru unii compuși în soluție și impermeabile pentru alții sau pot atașa molecule de soluție. Atunci când se utilizează rotorul zonal, mitocondriile, lizozomii, peroxizomii și microsomii sunt concentrați în benzi cu 42%, 47%, 47% și 27% zaharoză, corespunzând densităților de 1,18, 1,21, 1,21 și respectiv 1,10 g-cm -3. Densitatea organelor subcelulare depinde și de absorbția selectivă a anumitor compuși. Administrarea WR-1339, un detergent Triton WR-1339, care nu provoacă hemoliză, duce la o creștere a dimensiunii și la o scădere a densității lizozomilor hepatici; densitatea mitocondriilor și a peroxizomului rămâne neschimbată. În ciuda faptului că proprietățile de sedimentare ale lizozomilor, de regulă, nu se modifică, densitatea lor de echilibru în gradientul zaharoză scade de la 1,21 la 1,1, ceea ce duce la o separare corespunzătoare a fracției lizozomale-peroxizomale. Această caracteristică este utilizată în separarea cantitativă a lizozomilor, mitocondriilor și peroxizomilor, pe baza îndepărtării dintr-un mediu omogen a tuturor particulelor cu o densitate mai mare decât în microsomi și a centrifugării izopicnice ulterioare a particulelor grele precipitate.

2.4 Centrifugarea cu gradient de densitate de echilibru

Pentru a crea un gradient de densitate, sunt utilizate săruri de metale grele, cum ar fi rubidiu sau cesiu, și soluții de zaharoză. O probă, cum ar fi ADN, este amestecată cu o soluție concentrată de clorură de cesiu. Atât solutul, cât și solventul sunt distribuite inițial uniform pe tot volumul. În cursul centrifugării, se stabilește o distribuție de echilibru a concentrației și, în consecință, densitatea CsCl, deoarece ionii de cesiu au o masă mare. Sub acțiunea accelerării centrifuge, moleculele de ADN sunt redistribuite, colectându-se sub forma unei zone separate în partea eprubetei cu densitatea corespunzătoare. Metoda este utilizată în principal în centrifugarea analitică și a fost utilizată de Meselson și Stahl pentru a studia mecanismul de replicare a ADN-ului. E. coli . Centrifugarea cu gradient de densitate de echilibru este, de asemenea, una dintre metodele de separare și studiere a lipoproteinelor plasmatice umane.

2. 5 Conturarea și extragerea gradienților

2.5.1 Natura gradienților

Pentru a crea gradienți de densitate a soluțiilor, soluțiile de zaharoză sunt cel mai des utilizate, uneori cu un pH fix. În unele cazuri, o bună separare se obține folosind D 2 0 în loc de apă obișnuită. 2.1 prezintă proprietățile unor soluții de zaharoză.

2.5.2 Procedură pentru crearea unui gradient de densitate în trepte

2.5.3 Tehnica pentru crearea unui gradient de densitate netedă

2.5.4 Extragerea gradienților din tuburile de centrifugă

2.5.5 Centrifuge preparative și aplicațiile acestora

Centrifugele preparative pot fi clasificate în trei grupe principale: centrifugele de uz general, centrifugele de mare viteză și ultracentrifugele pregătitoare. Centrifuge de uz general dați o viteză maximă de 6000 rpm -1 și OCU până la 6000 g . Acestea diferă între ele doar prin capacitate și au un număr de rotoare înlocuibile: unghiulare și cu ochelari suspendați. Una dintre caracteristicile acestui tip de centrifugă este capacitatea lor mare - de la 4 la 6 dm 3, care le permite să fie încărcate nu numai cu tuburi de centrifugă de 10,50 și 100 cm 3, ci și cu nave cu o capacitate de până la 1,25 dm 3. La toate centrifugele de acest tip, rotoarele sunt atașate rigid la arborele de antrenare, iar tuburile centrifugii, împreună cu conținutul lor, trebuie să fie echilibrate cu atenție și să difere în greutate cu cel mult 0,25 g. Nu puteți încărca un număr impar de tuburi în rotor și, dacă rotorul nu este complet încărcat, tuburile trebuie plasate simetric, unul împotriva celuilalt, asigurând astfel distribuția uniformă a tuburilor în jurul axei de rotație a rotorului.

Centrifuge de mare viteză dați o viteză limitativă de 25.000 rpm -1 și OCU până la 89.000g. Camera rotorului este echipată cu un sistem de răcire care previne încălzirea cauzată de frecare în timpul rotației rotorului. De regulă, centrifugele de mare viteză au o capacitate de 1,5 dm 3 și sunt echipate cu rotoare înlocuibile, atât cu unghiuri cât și cu boluri suspendate.

Ultracentrifuge preparative dați o viteză maximă de până la 75.000 rpm -1 și o accelerație centrifugă maximă de 510.000 g . Acestea sunt echipate atât cu un frigider, cât și cu o unitate de vid pentru a preveni supraîncălzirea rotorului din cauza fricțiunii împotriva aerului. Rotoarele unor astfel de centrifuge sunt fabricate din aliaje de aluminiu sau titan de înaltă rezistență. Rotoarele din aliaje de aluminiu sunt utilizate în principal, cu toate acestea, în cazurile în care sunt necesare viteze deosebit de mari, sunt utilizate rotoare din titan. Pentru a reduce vibrațiile rezultate din dezechilibrul rotorului datorită umplerii neuniforme a tuburilor de centrifugă, ultracentrifugele au un arbore flexibil. Tuburile de centrifugă și conținutul acestora trebuie echilibrate cu atenție până la cel mai apropiat de 0,1 g. Cerințe similare trebuie respectate la încărcarea rotoarelor de centrifugă de uz general.

2.6 Proiectarea rotoarelor

2.6.1 Rotoare unghiulare și rotoare cu boluri suspendate

2.6.2 Rotoare continue

Rotoarele continue sunt proiectate pentru fracționarea de mare viteză a unor cantități relativ mici de material solid din suspensii de volume mari, de exemplu, pentru izolarea celulelor din mediile de cultură. În timpul centrifugării, suspensia de particule este adăugată continuu la rotor; debitul rotorului depinde de natura preparatului precipitat și variază de la 100 cm 3 la 1 dm 3 în 1 min. Particularitatea rotorului este că este o cameră izolată cu un design special; conținutul său nu comunică cu mediul extern și, prin urmare, nu este contaminat sau pulverizat.

2.6.3 Rotoare de zonă sau rotoare Anderson

Rotorul este umplut când se rotește cu o viteză de aproximativ 3000 rpm -1. Un gradient creat anterior este injectat în rotor, pornind de la stratul cu cea mai mică densitate, care este distribuit uniform de-a lungul periferiei rotorului și este ținut de peretele său exterior perpendicular pe axa de rotație datorită forței centrifuge . Adăugarea ulterioară a straturilor cu gradient de densitate mai mare se deplasează continuu spre centrul straturilor mai puțin dense. După ce întregul gradient a fost pompat în rotor, acesta este umplut până la volumul său maxim cu o soluție numită „pernă”, a cărei densitate este aceeași sau depășește ușor cea mai mare densitate a gradientului preformat.

Apoi, prin tubul axial, eșantionul de testare este stratificat , care este deplasat din tub în volumul rotorului folosind o soluție de densitate mai mică, în timp ce același volum al „pernei” este îndepărtat de la periferie. După toate aceste proceduri, viteza rotorului este adusă la viteza de lucru și pentru perioada de timp necesară se efectuează fie fracționarea zonală, fie fracționarea zopică-izopicnică. . Extracția fracțiilor se efectuează la o viteză a rotorului de 3000 rpm - min -1. Conținutul rotorului este deplasat prin adăugarea unei "perne" din periferie, în primul rând, straturile mai puțin dense sunt deplasate . Datorită designului special al canalului axial al rotorului Anderson, nu există amestecarea zonelor atunci când acestea sunt deplasate. Gradientul de ieșire este trecut printr-un dispozitiv de înregistrare, de exemplu, o celulă de spectrofotometru, cu ajutorul căreia conținutul de proteine poate fi determinat prin absorbție la 280 nm sau printr-un detector special de radioactivitate, după care se colectează fracțiile.

Capacitatea rotoarelor zonale utilizate la viteze medii variază de la 650 la 1600 cm 3, ceea ce permite obținerea unei cantități destul de mari de material. Rotoarele de zonă sunt utilizate pentru a elimina contaminanții proteici din diferite preparate și pentru a izola și purifica mitocondriile, lizozomii, polizomii și proteinele.

2.6.4 Analiza fracțiilor subcelulare

Proprietățile particulelor subcelulare obținute prin fracționarea preparatului pot fi atribuite proprietăților particulelor în sine numai dacă preparatul nu conține impurități. Prin urmare, este întotdeauna necesar să se evalueze puritatea preparatelor primite. Eficiența omogenizării și prezența impurităților în preparat pot fi determinate prin examinare microscopică. Cu toate acestea, absența impurităților vizibile nu este încă o dovadă fiabilă a purității preparatului. Pentru o evaluare cantitativă a purității, preparatul rezultat este supus analizei chimice, ceea ce face posibilă stabilirea conținutului de proteine sau ADN din acesta, determinarea activității sale enzimatice, dacă este posibil, și a proprietăților imunologice.

Analiza distribuției enzimelor în țesuturile fracționate se bazează pe două principii generale. Primul este că toate particulele dintr-o anumită populație subcelulară conțin același set de enzime. Al doilea presupune că fiecare enzimă este localizată într-un anumit loc din celulă. Dacă această poziție ar fi adevărată, atunci enzimele ar putea acționa ca markeri pentru organitele corespunzătoare: de exemplu, citocrom oxidaza și monoaminooxidaza ar servi ca markeri mitocondriale, hidrolazele acide ca markeri ai lizozomilor, catalaza ca markeri ai peroxizomilor și glucoza-6- fosfataza - un marker al membranelor microsomice. S-a dovedit totuși că unele enzime, de exemplu malat dehidrogenază, R-glucuronidaza, NADPH-citocrom-c-reductaza, sunt localizate în mai mult de o fracțiune. Prin urmare, alegerea enzimelor-markeri a fracțiunilor subcelulare în fiecare caz ar trebui abordată cu mare atenție. Mai mult, absența unei enzime marker nu înseamnă absența organelor adecvate Este probabil ca în timpul fracționării enzima să fie pierdută de organite sau să fie inhibată sau inactivată; prin urmare, pentru fiecare fracție, sunt de obicei determinate cel puțin două enzime marker.

Fracțiune	Volum, cm "	Ameliorare generală	Acțiune, 660 nm	Unități de activitate enzimatică	Randamentul activității în fracție,%

2.7 Fracționarea diferențială a centrifugării

2.7.1 Exprimarea rezultatelor

2.7.2 Ultracentrifugare analitică

Ultracentrifugele analitice pot atinge viteze de până la 70.000 rpm -1, creând în același timp o accelerație centrifugă de până la 500.000 g . Rotorul lor, de regulă, are forma unui elipsoid și este conectat printr-un șir la un motor, ceea ce vă permite să variați viteza de rotație a rotorului. Rotorul se rotește într-o cameră de vid dotată cu un dispozitiv de refrigerare și are două celule, una analitică și una de echilibrare, care sunt instalate în centrifugă strict vertical, paralel cu axa de rotație. Celula de echilibrare este utilizată pentru echilibrarea celulei analitice și este un bloc metalic cu un sistem de precizie. De asemenea, conține două găuri index situate la o distanță strict definită de axa de rotație, cu ajutorul cărora sunt determinate distanțele corespunzătoare în celula analitică. Celula analitică, a cărei capacitate este de obicei de 1 cm 3, are o formă sectorială. Când este instalat corect în rotor, deși stă în poziție verticală, funcționează pe același principiu ca un rotor cu boluri suspendate, creând condiții de sedimentare aproape ideale. La capetele celulei analitice există ferestre cu sticlă de cuarț. Ultracentrifugele analitice sunt echipate cu sisteme optice care permit observarea sedimentării particulelor pe parcursul întregii perioade de centrifugare. La intervale prestabilite, materialul sedimentar poate fi fotografiat. La fracționarea proteinelor și a ADN-ului, sedimentarea este monitorizată prin absorbție în lumina ultravioletă și în cazurile în care soluțiile studiate au indici de refracție diferiți, utilizând un sistem schlieren sau sistemul de interferență al lui Rayleigh. Ultimele două metode se bazează pe faptul că atunci când lumina trece printr-o soluție transparentă formată din zone cu densități diferite, refracția luminii are loc la marginea zonelor. În timpul sedimentării, se formează o graniță între zonele cu particule grele și ușoare, care acționează ca o lentilă de refracție; în acest caz, un vârf apare pe placa fotografică utilizată ca detector. În timpul sedimentării, granița se mișcă și, în consecință, vârful, după viteza de mișcare a cărei viteză de sedimentare a materialului poate fi judecată. Sistemele interferometrice sunt mai sensibile decât sistemele schlieren. Celulele analitice sunt un sector, care sunt utilizate cel mai des, și două sector, care sunt utilizate pentru studiul comparativ al solventului și al substanței dizolvate.

2.8 Aplicații ale ultracentrifugării analitice

2.8.1 Determinarea greutăților moleculare

Determinarea greutății moleculare prin viteza de sedimentare - aceasta este cea mai comună metodă. Centrifugarea se efectuează la viteze mari, astfel încât particulele, distribuite inițial uniform pe tot volumul, încep să se miște pentru a se deplasa de-a lungul razei de la centrul de rotație. Se formează o interfață clară între regiunea solventului, care este deja lipsită de particule, și partea care le conține. Această limită se mișcă în timpul centrifugării, ceea ce face posibilă determinarea vitezei de sedimentare a particulelor folosind una dintre metodele menționate mai sus, înregistrând această mișcare pe o placă fotografică.

Viteza de sedimentare este determinată de următorul raport:

Unde NS - distanța de la axa de rotație în cm,

t - timpul în s,

w - viteza unghiulară în rad-s -1,

s - coeficientul de sedimentare "al moleculei.

Coeficientul de sedimentare este viteza pe unitate de accelerație și se măsoară în Unități Seedberg ; 1 unitate de Swedberg este egală cu 10 _13 s. Valoarea numerică a lui s depinde de greutatea moleculară și forma particulelor și este o cantitate caracteristică unei molecule date sau a unei structuri supramoleculare. De exemplu, coeficientul de sedimentare al lizozimei este de 2,15 S; catalaza are un coeficient de sedimentare de 11.35S, subunitățile ribozomului bacterian - de la 30 la 50S și subunitățile ribozomului eucariot - de la 40 la 60S.

Unde M - greutatea moleculară a unei molecule, R - constanta gazului, T este temperatura absolută, s este coeficientul de sedimentare al moleculei, D este coeficientul de difuzie al moleculei, v este volumul specific parțial, care poate fi considerat ca volumul ocupat de un gram de dizolvat, p este densitatea solventului.

Metoda echilibrului de sedimentare. Determinarea greutăților moleculare prin această metodă se efectuează la viteze relativ mici ale rotorului, de ordinul 7.000-8.000 rpm -1, astfel încât moleculele cu o greutate moleculară ridicată să nu se așeze pe fund. Ultracentrifugarea se efectuează până când particulele ajung la echilibru, care se stabilește sub acțiunea forțelor centrifuge, pe de o parte, și a forțelor de difuzie, pe de altă parte, adică până când particulele încetează să se miște. Apoi, gradientul de concentrație rezultat este utilizat pentru a calcula greutatea moleculară a substanței "conform formulei

Unde R - constanta gazului, T este temperatura absolută, ω este viteza unghiulară, p este densitatea solventului, v - volum specific parțial, cu NS și cu 2 - concentrația solutului la distanțe G G și r 2 de pe axa de rotație.

Dezavantajul acestei metode este că este nevoie de mult timp pentru a obține echilibrul de sedimentare - de la câteva zile la câteva săptămâni cu funcționarea continuă a centrifugei.

Unde R - constanta gazului, T - temperatura absolută, v - volum specific parțial, p este densitatea solventului, dcldr - gradientul concentrației macromoleculei, gm și dd - distanța până la menisc și fundul eprubetei, respectiv, cm și sd - concentrația macromoleculelor la menisc și respectiv la fundul eprubetei , M m și M R - valorile greutăților moleculare, determinate de distribuția concentrației substanței la menisc și respectiv la fundul eprubetei.

2.8.2 Evaluarea purității medicamentelor

2.8.3 Studiul modificărilor conformaționale în macromolecule

Formarea produselor tubulare prin metodă centrifugare... Sub centrifugareîn industria materialelor de construcție ... care este un astfel de impact sunt numite centrifugare... În industria Republicii Belarus, se folosesc centrifugele orizontale ...

Sedimentarea particulelor

Lucrări de laborator >> Chimie

Celulele deja eliberate cu viteză redusă centrifugare din nucleu, mitocondrii și ... ultracentrifugare Caracteristici de acest tip centrifugare reflectat chiar în ... pentru noi un exemplu de utilizare centrifugareîn gradientul de densitate zaharoză, ...

Folosind o centrifugă

Cursuri >> Industrie, fabricație

În centrifugele discontinue, diverse operații centrifugare- încărcare, împărțire, descărcare - apar ... se face distincție între pregătitoare și analitică centrifugare... Cu pregătitoare centrifugare se ia materialul biologic inițial ...